第六章 菌种保藏与种子扩大培养技术 第一节 菌种保藏 一、菌种保藏的原理

1. 第六章 菌种保藏与种子扩大培养技术 第一节 菌种保藏 一、菌种保藏的原理 通常把生产菌株遗传标记的丢失以及生产能力的下降称为菌种退化，它是菌种自发突变的结果，而生产实践中的培养环境条件不适以及传代次数过多会加快菌种退化的进程。 菌种保藏的基本原理主要是根据菌种的生理、生化特点，人工地创造条件，使菌种处于代谢不活泼，生长繁殖受到抑制的休眠状态，以减少菌种的变异。一般保藏时首先要挑选优良纯种，最好时它们的休眠体（孢子、芽孢等）；其次是要创造一个有利于休眠的环境条件，如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等，即可以达到降低其代谢活动，延长保存期的目的。

2. 二、菌种保藏的方法 1. 斜面保藏法 这是一种短期、过渡的保藏方法，广泛适用于各种微生物的短期保藏。当微生物在适宜的斜面培养基和温度条件下生长良好后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为3~6个月，到期后需重新移接新斜面再行保藏。 2. 穿刺保藏法 此法是斜面保藏法的一种改进方法，常用于保藏很多种好气性细菌的保藏。方法是将培养基配制成软琼脂培养基，装入小试管内，高度为1~2cm，经121℃高温灭菌后使其凝固（不制成斜面）。接种时，用接种针将菌种穿刺接入培养基的1/2处。经培养，微生物在穿刺处及琼脂表面均可生长，在培养基上覆盖2~3mm的无菌液体石蜡，放入4℃冰箱保存，可保藏6~12个月。 3. 真空冷冻干燥保藏法 由于该保藏方法具有保藏期长、变异小、适用范围广以及便于大量保藏等优点，是目前比较理想的保藏方法，因此，此法为各保藏机构广泛采用。其基本原理是将微生物或孢子冻结，然后在减压情况下使水分升华，使细胞的生长代谢等生命活动处于停止状态，从而得以长期保藏。 4. 液氮保藏法 液氮的温度可达-196℃，远远低于微生物新陈代谢作用停止的温度（-130℃），因此，用液氮能够长期保存菌种，可达9年之久。 5. 低温保藏法 大多数的微生物可在-20℃以下的低温中保藏。

3. 第二节 种子扩大培养目的、流程与影响因素 一、种子扩大培养的目的 种子扩大培养是指将处于休眠状态的保藏菌种接入试管斜面活化后，再经过摇瓶、种子罐等逐级扩大培养，从而获得一定数量和质量的纯种的过程。所获得的纯种培养物就称之为种子，作为种子必须具备的条件是：无杂菌污染；生理状态稳定，保持稳定的生产性能；活力旺盛，移接至发酵罐后能够迅速生长；菌体总量能够满足发酵罐所需的接种量。 二、种子扩大培养的流程 1. 种子扩大培养的一般流程 氨基酸生产中，种子扩大培养的一般流程如下（图6-1）：

4. 2. 实验室种子的制备 实验室种子制备阶段包括保藏菌种的活化以及摇瓶培养。 ① 斜面菌种的培养 安瓿管低温保藏的菌种通常要移接到斜面2~3次，经过活化后才应用于生产。一般每次活化时移接一批斜面，其中一部分以斜面形式进行短期保藏，供一段时间（1~2个月）取用。 ② 一级种子的摇瓶培养 在实验室里，采用三角瓶等进行液体恒温振荡培养种子的过程称为摇瓶培养，所得的种子称为一级种子。振荡器有液体恒温控制和气体恒温控制两种，生产中摇瓶数量较多，通常采用气体恒温控制方式进行培养。 3. 生产车间种子的制备 氨基酸发酵生产上，在生产车间以种子罐进行种子培养。种子罐的大小需根据发酵工艺要求和发酵罐容积大小来确定，目前氨基酸生产工艺一般要求接种量为10%左右，故种子罐溶积一般为发酵罐容积的10%左右。如果发酵罐容积极大，而菌种生长又比较缓慢，可考虑采用多级种子罐完成种子的扩大培养。例如，有些工厂的赖氨酸发酵罐为300m3，采用了3m3种子罐和30m3种子罐进行逐级培养，即先把一级种子接入3m3种子罐培养至一定菌体浓度，然后再移接到30m3种子罐，培养成熟后才移接到发酵罐。这一过程通常称为三级种子培养流程，3m3种子罐培养的种子为二级种子，30m3种子罐培养的种子为三级种子。但为了减少染菌机会，对于生长迅速的菌种，如谷氨酸生产菌种，一般采用二级扩大培养流程。种子罐的搅拌转速以及其它结构根据菌种以及工艺的不同而定。

5. 三、影响种子质量的主要因素 1. 培养基 种子培养基以培养菌种为目的，其培养基的糖分一般较少，对微生物生长起主导作用的氮源相对多一些，而且氮源中无机氮源的比例要大一些。 2. 接种龄与接种量 接种龄是指各级培养的种子开始移入下一级种子工序或发酵罐时的培养时间。通常接种龄以菌体处于生命极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体尚未达到最高峰时较为合适。 人们习惯将移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例称为接种量。应该根据实际情况选择适宜的接种量。 3. 温度 每种微生物都有自己的最高生长温度和最低生长温度。在种子扩大培养过程中，应根据菌种的特性采取相应的培养温度。 4. pH 各种微生物都有自己生长与合成酶的最适pH值。 5. 通气与搅拌 目前氨基酸生产菌种的生长都需要氧气的供给。不同菌种要求通气量不同，即使是同一种菌种，不同生理时期对通气量的要求也不同。 6. 泡沫 培养过程中，由于通气与搅拌，微生物代谢活动产生气泡，以及培养基中存在一定量蛋白质或其它胶体物质，容易在培养基中形成泡沫。泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，破坏其生理代谢的正常进行。

6. 第三节 谷氨酸生产扩大培养技术 一、 谷氨酸二级扩大培养过程的控制要点 国内谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子培养的流程，即：斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵罐。 1. 斜面菌种的培养 ① 斜面培养基组成 葡萄糖0.1% ,蛋白胨1.0%，牛肉膏1.0%，氯化钠0.5%，琼脂2.0~2.5%，pH7.0~7.2， 121℃灭菌20min。（传代和保藏斜面不加葡萄糖） ② 培养条件 谷氨酸斜面菌种一般在30~32℃培养18~24h。

7. 2. 一级种子培养 ① 摇瓶培养基组成 葡萄糖2.5%，尿素0.5%，MgSO4﹒7H2O 0.05%，磷酸二氢钾0.12%，玉米浆2.5~3.5% ,硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm，调节pH 7.0，每个1000mL三角瓶分装培养基200mL，121℃灭菌20min。 ② 培养条件 冷却后接入斜面菌种，置于冲程8.0cm左右、频率100次/min左右的往复式摇床上恒温32~33℃振荡培养9~10小时。 ③ 一级种子质量要求 种龄：9~10h pH值：6.8~7.0 光密度：净增OD650值0.5以上（581比色计650nm） 残糖：1.0%左右 无菌检查：（-） 噬菌体检查：无 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐，革兰氏阳性反应。

8. 3. 二级种子培养 ① 培养基组成 葡萄糖45g/L，MgSO4﹒7H2O 0.7 g/L，磷酸二氢钾1.5 g/L，糖蜜125g/L，玉米浆250g/L，纯生物素18.8 μg/L，硫酸亚铁、硫酸锰 各2ppm，实消，121℃保温10min，实消前不需调节pH，实消降温后用液氨调节至pH7.0。 ② 培养条件 接种量：0.03~0.5%(根据工厂的条件而定)， 培养温度：32~34℃， 搅拌转速：一般是150~300r/min。 通气比：0.15~0.35vvm。 培养时间：目前生产上通常在12~14个小时。 培养pH值：一般控制pH6.8~8.0。 ③ 二级种子的质量要求 种龄：视培养工艺而定，一般在8h以上； OD值：视培养工艺而定，一般净增OD650≥0.5； pH值：一般为pH7.0~7.2； 残糖：10~15 g/L； 无菌检查：（-）， 噬菌体检查：无， 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐，革兰氏阳性反应。 ④ 流加液氨培养工艺的优点 采用尿素作为氮源的培养过程中，pH波动幅度较大，对菌种生长有影响；而采用流加液氨的培养过程中，可以控制pH在较小的范围内波动，适宜菌种生长。

9. 二、 接种操作要点 1. 一级种子接入种子罐的操作 ① 金属种瓶 ② 接种操作 2. 二级种子接入发酵罐的操作 ① 移种管道的灭菌 ② 移种