1 / 31

Vyu ž ití molekulárních marker ů v systematice a popula č ní biologii rostlin

Vyu ž ití molekulárních marker ů v systematice a popula č ní biologii rostlin. 6. Mikrosatelity. Co jsou mikrosatelity ?. simple sequence repeats (SSRs) short tandem repeats (STRs) tandemové repetice, kratší ne ž 6 bp, zpravidla 2 , 3 nebo 4 bp …GTTCTGTC ATATATATATATAT---- CGTACTT…

rea
Download Presentation

Vyu ž ití molekulárních marker ů v systematice a popula č ní biologii rostlin

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin 6. Mikrosatelity

  2. Co jsou mikrosatelity ? • simple sequence repeats (SSRs) • short tandem repeats (STRs) • tandemové repetice, kratší než6 bp, zpravidla 2, 3 nebo 4 bp …GTTCTGTCATATATATATATAT----CGTACTT… …GTTCTGTCATATATATATATATATATCGTACTT… • alely jsou dány různým počtem opakování • PCR - délkový polymorfismus

  3. Typy mikrosatelitů • jednoduché (simple) …CACACACACACACACACACACA… • složené (compound) …CACACACACATGTGTGTGTGTG… • přerušované (interrupted) …CACACATTCACACATTCACA…

  4. Repetitivní sekvence • dinukleotidy • nejběžnější u rostlin AT opakování • cca každých 30-50 kb • počet jednotek je do 30 • trinukleotidy • vyskytují se i v exonech • neporušují čtecí rámec • GTG – subtelomerická lokalizace na chromozomu • tetranukleotidy • téměř výhradně GATA/GACA • výskyt poblíž centromer • často složené nebo přerušované

  5. …GTTCTGTCATATATATATATATATATCGTACTTA… Charakteristiky mikrosatelitů • single locus – vysoce specifické • častý výskyt v genomu • rozmístěny po celém genomu • vysoký polymorfismus – mnoho alel • kodominantní dědičnost • ALE – musíme znát primery (tj. sekvence flanking regions - okolních úseků)

  6. Rozmístění v genomu • výskyt v celém genomu (ALE – odráží variabilitu pouze studovaných lokusů, tj. omezeného množství) • spíše v nekodujících oblastech • jaderné mikrosatelity • druhově specifické • chloroplastové mikrosatelity • téměř výhradně opakování jediné báze – např. (T)12 • okolí (flanking regions) – méně variabilní – možnost designu konsenzuálních primerů

  7. …GTTCTGTCATATATATATATCGTACTT… celková DNA PCR – specifický pár primerů Zjištění polymorfismu

  8. Mikrosatelitové primery • specifické pro daný lokus – pouze jednou v genomu • specifické pro konkrétní druh • pro studovaný druh existují (publikované)(např. v Molecular Ecology Resources, dříve ME Notes) • rešerše – http://botany.natur.cuni.cz/dna/primers/publikSSRs.htm • prohledání genové banky – pro modelové organismy • nutno si vytvořit (izolovat)

  9. celková DNA restrikce vložení doplazmidu fragmenty300-700 bp transformace CTGTATATATATATATATCGCTT GCCTGCATATATATATGCTATTG GCTTACATATATATATGTACTTG sekvenování pozitivních klonů detekce pozitivních klonů designprimerů test funkčnosti primeru a polymorfismu lokusu F: CTGT R: CGCTT F: GCCTGC R: GCTATTG F: GCTTAC R: GTACTTG Izolace primerů

  10. Interpretace gelů • „stutter bands“ – přídavné proužky okolo správně dlouhého (nejintenzivnějšího)– in vitro DNA slippage • „terminal transferase activity“ – tendence Taq polymerázy přidávat A na 3´-konec

  11. Interpretace gelů II. stutter bands- produkty o 2, 4, 6 atd. bp kratší- nejvyšší peak nejdelší – skutečná alela stutter bands a -A produkty- sttuter bands o 2, 4, 6 atd. bp kratší- ke každému proužku i -A produkt označují skutečné alely

  12. Automatická analýza (GeneMarker)

  13. Jak hodnotit tetraploidy • jako dominantní data • přítomnost/nepřítomnost alel • kodominantně • tři alely – jedna z nich je dvakrát, ale která?(tj. hodnotíme jako 3 alely + chybějící • dvě alely – každá dvakrát nebo jedna třikrát? • autopolyploidi/allopolyploidi • software – SPAGeDi, ATETRA, TETRASAT…

  14. Tetraploidní data (Phragmites)

  15. Vznik polymorfismu • DNA „slippage“ • „sklouznutí“ DNA polymerázy při replikaci • prodloužení nebo zkrácení o jednotku • „unequal crossing over“ • rozsáhlejší změny • mutační rychlost je vysoká – 10-3 - 10-5

  16. Mutace mikrosatelitů • o podstatě mutací mikrosatelitů se ví málo • rychlost se odhaduje na 10-3 - 10-5 • liší se u 2, 3 a 4 bp opakování • podle typu mikrosatelitu • různá u různých druhů … • mutační rychlost – balance mezi vznikem mutací a jejich opravou • nejčastěji – ztráta nebo získání jedné jednotky

  17. identical in state (IIS) identical by descent (IBD) Homologie alel 6 ATATATATATAT 5ATATATATAT.. 5ATATATATAT.. ATATATATAT.. 5 ATATATAT.... 4

  18. Mutační modely • infinite alleles model (IAM) – Kimura & Crow 1964 • mutace vytváří novou alelu danou rychlostí u • nepovoluje homoplasie • identické alely jsou IBD • stepwise mutation model (SMM) – Kimura & Ohta 1978 • nová alela vzniká přidáním nebo ztrátou jedné jednotky • stejná pravděpodobnost ztráty i přidání (u/2) • generuje homoplasie (alely nejsou IBD, pouze IIS) • alely o podobné délce jsou více příbuzné • two-phase model (TPM) – DiRienzo et al. 1994 • modifikace o 1 jednotku s pravděpodobností p • modifikace o více než 1 jednotku s pravděpodobností 1-p

  19. Nulové alely • ztráta PCR produktu mutací v priming site • tj. podhodnocení heterozygotů – někteří se jeví jako homozygoti • identifikace pouze studiem potomků – alela není zděděna • frekvence se zvyšuje použitím heterologních primerů (z příbuzných druhů) • frekvenci možno odhadnout na základě odchylky od H-W rovnováhy (např. program Cervus)

  20. Vyhodnocování dat • kodominantní marker – alelické vyhodnocení (jako allozymy) • heterozygosita (pozorovaná, očekávaná) • F-statistika (FIS)… • vzdálenosti (mezi populacemi, jedinci) • proporce sdílených alel (Dps) • Nei´s chord distance (Da) • Nei´s standard distance (D) • specifické koeficienty pro mikrosatelity • RST – analog FST (Slatkin 1995) • obsahuje logiku SMM (stepwise mutation model - založen na varianci v délce alel) • odhady – ρST (Rousset 1996) • vzdálenosti • delta mu – (dm)2, Ddm (Goldstein et al. 1995) • Dsw – stepwise weighted genetic distance • … • software • MICROSAT (Minch 1996) • MSA – Microsatellite Analyser (Dieringer & Schlötterer 2003)

  21. Využití mikrosatelitů • analýza rodičovství (parentage analysis) • určení rodičů semen (semenáčků) v populacích • identifikace klonů • populačně-genetické studie • inbreeding, odchylky od H-W rovnováhy • genový tok, migrace • historie populací, efektivní velikost populací … • systematika • problematické využití – homologie alel? • pouze do úrovně blízce příbuzných druhů • nutno použít mnoho lokusů • spíše cpDNA SSRs – díky vlastnostem cpDNA… • hybridizace • odlišení F1 hybridů a zpětných hybridů

  22. Analýza rodičovství (parentage analysis) • přímé určení vzdálenosti a četnosti šíření • semen – vzdálenost mezi semenem a rodičem • pylu – vzdálenost mezi rodiči • úspěch jednotlivých genotypů v populaci • podíl „jedinců-otců“ na opylení • předpoklady • genotypy všech potenciálních rodičů (rel. nízký počet) • variabilní marker – mikrosatelity, AFLP

  23. Metody parentage analysis • vylučovací metodou – exclusion analysis • nekompatibilita mezi genotypy rodičů a předpokládaného potomka  zamítnutí hypotézy • tj. zamítnutí všech až na jednoho, resp. dva • problémy – chyby ve skórování gelu, nulové alely, mutace • categorical allocation • výpočet LOD score (logarithm of the likelihood ratio) • rodiče mají nejvyšší LOD score • výhoda – méně citlivé k chybám a mutacím • software – např. CERVUS (Marshall et al. 1998)

  24. Identifikace klonů • klon = stejný multilokusový genotyp (tj. stejné alely ve všech lokusech) Phragmites australis v povodí Labe (Fér & Hroudová 2009)

  25. Identifikace klonů • pozor na rozlišovací schopnost markerů • síla markeru (marker power) • MLG (multilocus genotype) • pokud nalezen více než jedenkrát – spočítat tzv. Psex, tj. pravděpodobnost, že tento MLG mohl vzniknout náhodou při jiné generativní události – software GenClone, MLGSIM nedostatečná variabilita dostatečná variabilita Arnaud-Haond et al. (2005): Assessing genetic diversity in clonal organisms: Low diversity or low resolution? Combining power and cost efficiency in selecting markers. Journal of Heredity 96:434-440 Arnaud-Haond et al. (2007): Standardizing methods to address clonality in population studies. Molecular Ecology 16: 5115–5139

  26. Genový tok – nepřímé určení Edh K. et al. (2007): Nuclear and chloroplast microsatellites reveal extremepopulation differentiationand limited gene flow inthe Aegean endemic Brassica cretica (Brassicaceae). Mol. Ecol. 16, 4972-4983.

  27. Určení fylogeneze Hordeum cpDNA mikrosatelity Provan J. et al. (1999): Polymorphic chloroplast simple sequence repeats for systematic and population studies in the genus Hordeum. Molecular Ecology 8, 505-511.

  28. Hybridizace Typha, Snow et al., unpubl.

  29. Populační studie Kameyama Y. et al. (2001): Patterns and levels of gene flow in Rhododendron metternichii var. hondoense revealed by microsatellite analysis. Molecular Ecology 10:205-216

  30. Systematická studie Provan J. et al. (1999): Polymorphic chloroplast simple sequence repeat primers for systematic and population studies in the genus Hordeum. Molecular Ecology 8:505-511

  31. Literatura Jarne P. & Lagoda P.J.L. (1996): Microsatelites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology & Evolution 11(10):424-429 Goldstein D.B. & Schlötterer Ch. (1999): Microsatellites. Evolution and Applications. Oxford University Press Provan J. et al. (2001): Chloroplast microsatellites: new tools for studies in plant ecology and evolution. Trends in Ecology & Evolution 16(3):142-147 Lulkart G. & England P.R. (1999): Statistical analysis of microsatellite DNA data. Trends in Ecology & Evolution 14(7):253-256 Balloux F. & Lugon-Moulin N. (2002): The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology 11:155-165 Robinson J.P. & Harris S.A. (1999): Amplified Fragment Length Polymorphisms and Microsatellites: A phylogenetic perspective. In: Gillet E.M.[ed.]: Which DNA Marker for Which Purpose? http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/1999/whichmarker/index.htm Jones A.G. & Ardren W.R. (2003): Methods of parentage analysis in natural populations. Molecular Ecology 12:2511-2523

More Related