310 likes | 431 Views
Vyu ž ití molekulárních marker ů v systematice a popula č ní biologii rostlin. 6. Mikrosatelity. Co jsou mikrosatelity ?. simple sequence repeats (SSRs) short tandem repeats (STRs) tandemové repetice, kratší ne ž 6 bp, zpravidla 2 , 3 nebo 4 bp …GTTCTGTC ATATATATATATAT---- CGTACTT…
E N D
Využití molekulárních markerů v systematice a populační biologii rostlin 6. Mikrosatelity
Co jsou mikrosatelity ? • simple sequence repeats (SSRs) • short tandem repeats (STRs) • tandemové repetice, kratší než6 bp, zpravidla 2, 3 nebo 4 bp …GTTCTGTCATATATATATATAT----CGTACTT… …GTTCTGTCATATATATATATATATATCGTACTT… • alely jsou dány různým počtem opakování • PCR - délkový polymorfismus
Typy mikrosatelitů • jednoduché (simple) …CACACACACACACACACACACA… • složené (compound) …CACACACACATGTGTGTGTGTG… • přerušované (interrupted) …CACACATTCACACATTCACA…
Repetitivní sekvence • dinukleotidy • nejběžnější u rostlin AT opakování • cca každých 30-50 kb • počet jednotek je do 30 • trinukleotidy • vyskytují se i v exonech • neporušují čtecí rámec • GTG – subtelomerická lokalizace na chromozomu • tetranukleotidy • téměř výhradně GATA/GACA • výskyt poblíž centromer • často složené nebo přerušované
…GTTCTGTCATATATATATATATATATCGTACTTA… Charakteristiky mikrosatelitů • single locus – vysoce specifické • častý výskyt v genomu • rozmístěny po celém genomu • vysoký polymorfismus – mnoho alel • kodominantní dědičnost • ALE – musíme znát primery (tj. sekvence flanking regions - okolních úseků)
Rozmístění v genomu • výskyt v celém genomu (ALE – odráží variabilitu pouze studovaných lokusů, tj. omezeného množství) • spíše v nekodujících oblastech • jaderné mikrosatelity • druhově specifické • chloroplastové mikrosatelity • téměř výhradně opakování jediné báze – např. (T)12 • okolí (flanking regions) – méně variabilní – možnost designu konsenzuálních primerů
…GTTCTGTCATATATATATATCGTACTT… celková DNA PCR – specifický pár primerů Zjištění polymorfismu
Mikrosatelitové primery • specifické pro daný lokus – pouze jednou v genomu • specifické pro konkrétní druh • pro studovaný druh existují (publikované)(např. v Molecular Ecology Resources, dříve ME Notes) • rešerše – http://botany.natur.cuni.cz/dna/primers/publikSSRs.htm • prohledání genové banky – pro modelové organismy • nutno si vytvořit (izolovat)
celková DNA restrikce vložení doplazmidu fragmenty300-700 bp transformace CTGTATATATATATATATCGCTT GCCTGCATATATATATGCTATTG GCTTACATATATATATGTACTTG sekvenování pozitivních klonů detekce pozitivních klonů designprimerů test funkčnosti primeru a polymorfismu lokusu F: CTGT R: CGCTT F: GCCTGC R: GCTATTG F: GCTTAC R: GTACTTG Izolace primerů
Interpretace gelů • „stutter bands“ – přídavné proužky okolo správně dlouhého (nejintenzivnějšího)– in vitro DNA slippage • „terminal transferase activity“ – tendence Taq polymerázy přidávat A na 3´-konec
Interpretace gelů II. stutter bands- produkty o 2, 4, 6 atd. bp kratší- nejvyšší peak nejdelší – skutečná alela stutter bands a -A produkty- sttuter bands o 2, 4, 6 atd. bp kratší- ke každému proužku i -A produkt označují skutečné alely
Jak hodnotit tetraploidy • jako dominantní data • přítomnost/nepřítomnost alel • kodominantně • tři alely – jedna z nich je dvakrát, ale která?(tj. hodnotíme jako 3 alely + chybějící • dvě alely – každá dvakrát nebo jedna třikrát? • autopolyploidi/allopolyploidi • software – SPAGeDi, ATETRA, TETRASAT…
Vznik polymorfismu • DNA „slippage“ • „sklouznutí“ DNA polymerázy při replikaci • prodloužení nebo zkrácení o jednotku • „unequal crossing over“ • rozsáhlejší změny • mutační rychlost je vysoká – 10-3 - 10-5
Mutace mikrosatelitů • o podstatě mutací mikrosatelitů se ví málo • rychlost se odhaduje na 10-3 - 10-5 • liší se u 2, 3 a 4 bp opakování • podle typu mikrosatelitu • různá u různých druhů … • mutační rychlost – balance mezi vznikem mutací a jejich opravou • nejčastěji – ztráta nebo získání jedné jednotky
identical in state (IIS) identical by descent (IBD) Homologie alel 6 ATATATATATAT 5ATATATATAT.. 5ATATATATAT.. ATATATATAT.. 5 ATATATAT.... 4
Mutační modely • infinite alleles model (IAM) – Kimura & Crow 1964 • mutace vytváří novou alelu danou rychlostí u • nepovoluje homoplasie • identické alely jsou IBD • stepwise mutation model (SMM) – Kimura & Ohta 1978 • nová alela vzniká přidáním nebo ztrátou jedné jednotky • stejná pravděpodobnost ztráty i přidání (u/2) • generuje homoplasie (alely nejsou IBD, pouze IIS) • alely o podobné délce jsou více příbuzné • two-phase model (TPM) – DiRienzo et al. 1994 • modifikace o 1 jednotku s pravděpodobností p • modifikace o více než 1 jednotku s pravděpodobností 1-p
Nulové alely • ztráta PCR produktu mutací v priming site • tj. podhodnocení heterozygotů – někteří se jeví jako homozygoti • identifikace pouze studiem potomků – alela není zděděna • frekvence se zvyšuje použitím heterologních primerů (z příbuzných druhů) • frekvenci možno odhadnout na základě odchylky od H-W rovnováhy (např. program Cervus)
Vyhodnocování dat • kodominantní marker – alelické vyhodnocení (jako allozymy) • heterozygosita (pozorovaná, očekávaná) • F-statistika (FIS)… • vzdálenosti (mezi populacemi, jedinci) • proporce sdílených alel (Dps) • Nei´s chord distance (Da) • Nei´s standard distance (D) • specifické koeficienty pro mikrosatelity • RST – analog FST (Slatkin 1995) • obsahuje logiku SMM (stepwise mutation model - založen na varianci v délce alel) • odhady – ρST (Rousset 1996) • vzdálenosti • delta mu – (dm)2, Ddm (Goldstein et al. 1995) • Dsw – stepwise weighted genetic distance • … • software • MICROSAT (Minch 1996) • MSA – Microsatellite Analyser (Dieringer & Schlötterer 2003)
Využití mikrosatelitů • analýza rodičovství (parentage analysis) • určení rodičů semen (semenáčků) v populacích • identifikace klonů • populačně-genetické studie • inbreeding, odchylky od H-W rovnováhy • genový tok, migrace • historie populací, efektivní velikost populací … • systematika • problematické využití – homologie alel? • pouze do úrovně blízce příbuzných druhů • nutno použít mnoho lokusů • spíše cpDNA SSRs – díky vlastnostem cpDNA… • hybridizace • odlišení F1 hybridů a zpětných hybridů
Analýza rodičovství (parentage analysis) • přímé určení vzdálenosti a četnosti šíření • semen – vzdálenost mezi semenem a rodičem • pylu – vzdálenost mezi rodiči • úspěch jednotlivých genotypů v populaci • podíl „jedinců-otců“ na opylení • předpoklady • genotypy všech potenciálních rodičů (rel. nízký počet) • variabilní marker – mikrosatelity, AFLP
Metody parentage analysis • vylučovací metodou – exclusion analysis • nekompatibilita mezi genotypy rodičů a předpokládaného potomka zamítnutí hypotézy • tj. zamítnutí všech až na jednoho, resp. dva • problémy – chyby ve skórování gelu, nulové alely, mutace • categorical allocation • výpočet LOD score (logarithm of the likelihood ratio) • rodiče mají nejvyšší LOD score • výhoda – méně citlivé k chybám a mutacím • software – např. CERVUS (Marshall et al. 1998)
Identifikace klonů • klon = stejný multilokusový genotyp (tj. stejné alely ve všech lokusech) Phragmites australis v povodí Labe (Fér & Hroudová 2009)
Identifikace klonů • pozor na rozlišovací schopnost markerů • síla markeru (marker power) • MLG (multilocus genotype) • pokud nalezen více než jedenkrát – spočítat tzv. Psex, tj. pravděpodobnost, že tento MLG mohl vzniknout náhodou při jiné generativní události – software GenClone, MLGSIM nedostatečná variabilita dostatečná variabilita Arnaud-Haond et al. (2005): Assessing genetic diversity in clonal organisms: Low diversity or low resolution? Combining power and cost efficiency in selecting markers. Journal of Heredity 96:434-440 Arnaud-Haond et al. (2007): Standardizing methods to address clonality in population studies. Molecular Ecology 16: 5115–5139
Genový tok – nepřímé určení Edh K. et al. (2007): Nuclear and chloroplast microsatellites reveal extremepopulation differentiationand limited gene flow inthe Aegean endemic Brassica cretica (Brassicaceae). Mol. Ecol. 16, 4972-4983.
Určení fylogeneze Hordeum cpDNA mikrosatelity Provan J. et al. (1999): Polymorphic chloroplast simple sequence repeats for systematic and population studies in the genus Hordeum. Molecular Ecology 8, 505-511.
Hybridizace Typha, Snow et al., unpubl.
Populační studie Kameyama Y. et al. (2001): Patterns and levels of gene flow in Rhododendron metternichii var. hondoense revealed by microsatellite analysis. Molecular Ecology 10:205-216
Systematická studie Provan J. et al. (1999): Polymorphic chloroplast simple sequence repeat primers for systematic and population studies in the genus Hordeum. Molecular Ecology 8:505-511
Literatura Jarne P. & Lagoda P.J.L. (1996): Microsatelites, from molecules to populations and back. Trends in Ecology & Evolution 11(10):424-429 Goldstein D.B. & Schlötterer Ch. (1999): Microsatellites. Evolution and Applications. Oxford University Press Provan J. et al. (2001): Chloroplast microsatellites: new tools for studies in plant ecology and evolution. Trends in Ecology & Evolution 16(3):142-147 Lulkart G. & England P.R. (1999): Statistical analysis of microsatellite DNA data. Trends in Ecology & Evolution 14(7):253-256 Balloux F. & Lugon-Moulin N. (2002): The estimation of population differentiation with microsatellite markers. Molecular Ecology 11:155-165 Robinson J.P. & Harris S.A. (1999): Amplified Fragment Length Polymorphisms and Microsatellites: A phylogenetic perspective. In: Gillet E.M.[ed.]: Which DNA Marker for Which Purpose? http://webdoc.sub.gwdg.de/ebook/y/1999/whichmarker/index.htm Jones A.G. & Ardren W.R. (2003): Methods of parentage analysis in natural populations. Molecular Ecology 12:2511-2523