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流式细胞术 （ Flow Cytometry,FCM)

流式细胞术 （ Flow Cytometry,FCM). 作者：笛风. 基本概念. 1 、流式细胞仪 (Flow Cytometer): 是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 2 、流式细胞术 (Flow Cytometry): 利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达 1000-10000 个）的定量分析和分选（纯度可达 99% 以上）的技术。. 流式细胞仪结构. • 激光光源及光束形成系统 • 流动室及液流驱动系统 • 光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。

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流式细胞术 （ Flow Cytometry,FCM)

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Presentation Transcript

  1. 流式细胞术（Flow Cytometry,FCM) 作者：笛风

  2. 基本概念 1、流式细胞仪(Flow Cytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。 2、流式细胞术(Flow Cytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。

  3. 流式细胞仪结构 •激光光源及光束形成系统 •流动室及液流驱动系统 •光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源， 收集不同波长的荧光信号。 •信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿 电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。 •存储、显示、分析系统：计算机。 •细胞分选系统

  4. 流式免疫分型技术要点 • 标本的获取和运输 • 标本的制备和染色 • 仪器的校准和质控 • 流式细胞仪数据获取与储存

  5. FCM的主要测定指标 FSC, SSC, FL1, FL2, FL3 (FL4) 其中： FSC：反映细胞的大小 SSC：反映细胞内颗粒性

  6. FCM标记方法 单标： 一种单抗/tube: FL1, FSC, SSC（三参数） 双标： （两种单抗/tube）：FL1, FL1, FSC, SSC（四参数） 三/四标： （三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4, FSC, SSC

  7. 荧光素种类 • FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色 530nm • PE（藻红蛋白）：橙黄色 575nm • PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色 675nm • PI(碘化丙啶）：橙红色 620nm • 488nm波长的氩离子激光激发 • APC(别藻兰蛋白）：红色 660nm • 630nm波长的氦氖激光或红色二极管激光激发

  8. 抗体的选择 • PE最强，适用于弱表达抗原 • FITC最便宜，适用于强表达抗原，适用范围广 • biotin-avidin不适合 弱抗原的检测

  9. 数据显示方式 • 单参数直方图 • 双参数二维点图 • 等高图 • 二维密度图 • 三维图

  10. 流式常见图形 (Histogram Plot)

  11. 流式细胞的主要信息:Fluorescence • FL1 • FL2 • FL3 • FL4 最常用的标记方法是荧光素分子标记的抗体与细胞抗原结合

  12. 流式常见图形 (Histogram Plot) 适用于：单参数分析

  13. 流式常见图形 (Dot Plot) 适用于：多参数分析

  14. 第二节 流式细胞术的科研应用 • 分析群体细胞 • 所需时间短 • 多参数分析 • 定性或定量

  15. 流式应用常见范围 • 细胞大小 • 细胞的颗粒度 • 细胞表面分子：CD 系列 • 细胞浆内分子：胞内细胞因子 • 细胞核内分子：P53 • 细胞功能检测：细胞周期、凋亡

  16. 抗体标记的方法

  17. 抗体的选择 • 首选直接标记抗体 • 荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原 • 间接标记：适用范围广, biotin-avidin不适合弱抗原的检测

  18. 实验对照的设计 • 空白对照：ALL • 阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正） • 阳性对照：检测阴性时

  19. 空白对照和阴性对照的比较：

  20. 实验标本的处理 • 单细胞悬液的制备：胰酶消化 • 抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应 • 非特异结合的去除：洗涤和封闭 封闭：血清和同型抗体

  21. 流式检测应用实例 • 凋亡 • 细胞内分子检测

  22. 凋亡检测-每一步都有检测试剂盒

  23. 细胞周期 M G2 G1 G0 S Quiescent cells

  24. 细胞周期不能区分凋亡与死亡细胞Sub-G0/G1 peaks --- PI staining

  25. Caspases

  26. Annexin V Assay建议用于悬浮细胞

  27. Annexin V Assay能够区分死亡与凋亡

  28. 流式“TUNEL”

  29. Intracellular Cytokine-Protocol

  30. SORTING（细胞分选）

  31. DIMER X antigen specific T cell assay method for monitoring cellular response

  32. CBA(Cytometric Bead Array)

  33. Traditional Analysis -- Percent positive

  34. 10000 lymph FL2; 1000 (49,000 ABC) Linear Fluorescence in FL2 100 10 cell and bead neg 1 105 102 103 104 Molecules PE per Bead Determination of the CD4 PE ABC on lymphocytes

  35. 第三节 流式细胞术的临床应用 • 白血病免疫分型 • HLA-B27: 强直性脊柱炎 • 淋巴细胞亚群 • 造血干细胞计数：造血干细胞移植 • 网织红细胞 • PNH诊断（CD55、CD59） • 血小板活化试验

  36. 流式细胞白血病免疫分型

  37. 流式细胞的免疫分型 • 是白血病分型的重要指标 FAB标准，形态学和免疫表型结合 • 适合于白血病的分型诊断，但不适合用于确诊是不是白血病。 • Minimal residual diseases (MRD)

  38. FCM应用 • 1、细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 • 2、凋亡检测 • 3、免疫功能的检测 • 4、血液学应用 • 5、HLA-B27的检测：用于诊断强直性脊柱炎。 • 6、其他：溶液中细胞因子的测量。 • 7、细胞分选

  39. 细胞增殖周期测定和DNA倍体分析 • 1）细胞增殖周期：分为G0、G1、S、G2、M期。S期是DNA合成期，在S期 • 内，DNA进行复制，使细胞的DNA含量由2倍体（2C 46条染色体）变为4倍 • 体（4C）。G1和G2期为DNA合成前、后间期，此期无DNA的合成，但RNA和 • 蛋白质进行合成。M期为有丝分裂期，在此期一个细胞分裂为2个细胞。 • 细胞内的92条染色体分裂成2组46条染色体，使每个细胞内具有46条染色 • 体。在M期分裂成两个子细胞之前，G2和M期细胞的DNA含量均为恒定的4C • 。M期以后部分细胞进入G1期，继续进行增殖，部分细胞进入G0期，即静 • 止期，不再继续增殖。因此，FCM分析一个群体细胞峰DNA倍体与细胞周 • 期时，将DNA含量直方图分为三部分，即G0/G1,S,G2/M期三个细胞峰。 • G0/G1和G2/M细胞峰DNA的含量成正态分布，S期细胞峰则是一个加宽的正 • 态分布。

  40. 2）利用DNA的荧光染料，如PI（Propidium iodide碘化丙啶），与细胞内的DNA结合，可反映细胞内DNA含量。采用DNA直方图显示。具有2C DNA含量细胞为G0/G1期细胞，4C DNA含量细胞为G2/M期细胞，DNA含量介于两者之间的细胞为S期细胞。

  41. 3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量的变化。用DNA指数（DI）表示。3）DNA倍体：主要比较G0/G1期细胞DNA含量的变化。用DNA指数（DI）表示。 • DNA指数=测量样本G0/G1期DNA含量/正常人淋巴细胞G0/G1期DNA含量 以正常人淋巴细胞作为对照。 • 正常细胞DNA指数为1.00，DNA指数＞1，为超2倍体，＜1为亚2倍体，两者可统称为非整倍体。非整倍体细胞中肿瘤的特异性标志，实体肿瘤中出现频率较高。

  42. 第四节 凋亡检测 • 1）FCM-DNA检测（DNA亚G1峰的检测）：利用PI染色，检测具有亚G1期DNA含量的细胞比例，代表凋亡细胞数。其原理为在凋亡过程中，细胞内核酸酶的释放，将DNA降解，分解成小的片段，在标本制备中的固定处理时，细胞膜的完整性被破坏，使细胞内降解的DNA片段从细胞内流出，造成总体DNA含量减少，成为亚2倍体。注：检测的凋亡细胞数代表晚期的凋亡细胞比例，且易受标本中的死细胞和碎片的干扰，影响结果的准确性。 • 可参看文章： • http://www.biox.cn/content/cell/20040914791.htm • http://www.biox.cn/content/cell/20040914792.htm

  43. 2）DNA链损伤“TUNEL”法 • 3）Annexin-V-FITC/PI双染法 • 4）线粒体细胞膜电位的检测 • 5）凋亡相关基因的检测——免疫标记法检测基因

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