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1/39. タンパク質の結晶成長 - 実は結晶成長のモデル系？ -. 徳島大学工学部化学応用工学科 鈴木良尚. 2/39. 目次. 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ. 3/39. 結晶成長とは？. 希望の品質・サイズの結晶を得るためにその結晶の成長機構を研究する学問 相転移の非平衡統計力学の一分野. Si wafer, d = 300 mm, (100) oriented.
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1/39 タンパク質の結晶成長- 実は結晶成長のモデル系？ - 徳島大学工学部化学応用工学科 鈴木良尚
2/39 目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ
3/39 結晶成長とは？ • 希望の品質・サイズの結晶を得るためにその結晶の成長機構を研究する学問 • 相転移の非平衡統計力学の一分野 Si wafer, d = 300 mm, (100) oriented
4/39 核生成 成長 ……. 結晶の生い立ち 臨界核
5/39 過飽和度 • 過飽和度大→成長速度大 • 同じ過飽和度でも成長速度変化→速度論的要因
6/39 結晶の育ち方 らせん転位 (b) 二次元核成長 (a) 渦巻き成長
7/39 分子の結晶への取り込み過程 Diffusion Desorption Adsorption kink s step w h Surface diffusion
8/39 目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ
9/39 モデルタンパク質 • Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus) asymmetric unit tetramer
10/39 背景 *124 PDB holdings: 31306 X-ray: 27188 NMR: 4118 (27-Sep-2005) *89 *63 *19 *15 *A summary of progress in the Human Proteome Structural Genomics Pilot Project (http://proteome.bnl.gov/)
11/39 モデルタンパク質 • Glucose isomerase (from Streptomyces Rubiginosus) asymmetric unit tetramer
12/39 Visuri’s work 50 150 MPa 200 MPa Crystal concentration / g l-1 100 MPa 0.1 MPa 0 K. Visuri et al. Bio/Technology 8 (1990) 547. 0 30 t / min
13/39 核生成 成長 ……. 結晶の生い立ち 臨界核
14/39 目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ
15/39 試料調製 4 ℃ incubation Seed crystals 40℃ dissolution 0.45 mmf filtration Crystal Suspension Dilution Starting Solution Solution for Solubility measurements
16/39 グルコースイソメラーゼ結晶 Space group: I222 Unit cell*: a=9.388 nm, b=9.964 nm, c=10.290 nm (Z=2) *Carrell, H. L.; Glusker, J. P.; Burger, V.; Manfre, F.; Tritsch, D.; Biellmann, J.-F. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1989, 86, 4440-4444.
17/39 Morphology of the glucose isomerase crystal
18/39 過飽和度 • 過飽和度大→成長速度大 • 同じ過飽和度でも成長速度変化→速度論的要因
19/39 100 MPa 0.1 MPa {101} 面の成長速度過飽和度依存性
20/39 渦巻き成長 二次元核成長 (Birth & Spread model)
21/39 100 MPa 0.1 MPa 渦巻き成長 二次元核成長
22/39 ステップレッジ表面エネルギーの圧力変化 g(101) / kT p / MPa 4.1 ± 0.3 0.1 1.8 ± 0.3 100
23/39 目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ
24/39 結晶の面成長速度のみ→不確定要素あり 単位ステップの前進速度および二次元核生成頻度の測定が必要（しかも高圧力下！） レーザー共焦点微分干渉顕微鏡#で可能！ #G. Sazaki, T. Matsui, K. Tsukamoto, et. al.J. Cryst. Growth 2004, 262, 536-542.
25/39 目的 • ステップ前進速度の圧力依存性 • 二次元核生成頻度の圧力依存性
26/39 その場観察用高圧容器 50ｍｍ • TERAMECS Co., Ltd. • Max 100 MPa 50ｍｍ Φ3ｍｍ 45゜ 18.3ｍｍ Φ30ｍｍ
27/39 高圧容器内の結晶の配置と顕微鏡の位置関係 Crystal Sapphire window 7.6 mm LCM – DIM (Olympus, FV300 + IX71 + U-DICTHC ) Objective lens (Olympus, SLCPlanFl 40 X, WD = 7.6 mm, NA = 0.55 )
28/39 P = 0.1 MPa, 26.4 ℃, 5.6 mgml-1
29/39 P = 50 MPa, 26.4 ℃, 5.6 mgml-1
30/39 6.935 nm
31/39 h101 = 7.0 ± 0.7 nm
32/39 kink ekink s w h step ステップ前進速度
33/39 ステップ前進速度の濃度依存性
34/39 二次元核生成頻度
35/39 二次元核生成頻度の圧力依存性
36/39 二次元核生成頻度の過飽和度依存性
37/39 目次 1. 結晶成長基礎知識 2. タンパク質結晶を研究する意味 3. 結晶化機構のマクロな解析 （面成長速度） 4. 結晶化機構のミクロな解析 （ステップ前進速度と二次元核生成頻度） 5. まとめ
38/39 結論 • Pressure V(101) • Pressure Js(101) • タンパク質結晶 →結晶成長機構を探るモデル物質
39/39 謝辞 • 本研究の一部は東北大学金属材料研究所研究部共同研究の一環として行われました。改めて感謝申し上げます。 • メンバー 佐崎 元, 中嶋一雄 （東北大学金属材料研究所） 松本雅光, 永澤眞（テラメックス株式会社） 田村勝弘（徳島大学工学部）
Growth rate of {101} face 100 MPa 0.1 MPa Ce(0.1 MPa) =2.6±0.5 mg ml-1 Ce(100 MPa) =3.1±0.9 mg ml-1
Tetramer間 219.67 kJ/mol Tetramer形成 1200.42 kJ/mol Dimer形成 3053.98 kJ/mol Tetramer形成 972.80 kJ/mol
