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PCR 常见问题、原因分析及其对策

PCR 常见问题、原因分析及其对策. 主讲人：欧阳志荃. 主讲内容. PCR 技术简介. PCR 技术简介. PCR 常见问题、原因分析及其解决方案. 提高 PCR 反应特异性的策略. PCR 标准反应体系. DNA 模板 引物 反应缓冲液 dNTP ddH 2 O 耐热聚合酶. 反应体系对 PCR 扩增的影响. DNA 模板. 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制 PCR 反应 完整性 模板降解会导致 PCR 扩增无产物 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加 特异性 长度适当 、 避免二级结构和二聚体 完整性 避免反复冻融

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PCR 常见问题、原因分析及其对策

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Presentation Transcript

  1. PCR常见问题、原因分析及其对策 主讲人：欧阳志荃

  2. 主讲内容 PCR技术简介 PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略

  3. PCR标准反应体系 • DNA模板 • 引物 • 反应缓冲液 • dNTP • ddH2O • 耐热聚合酶

  4. 反应体系对PCR扩增的影响 DNA模板 • 纯度蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制PCR反应 • 完整性模板降解会导致PCR扩增无产物 • 浓度加量过多导致非特异性扩增增加 • 特异性长度适当、避免二级结构和二聚体 • 完整性避免反复冻融 • 浓度应适当,过高导致非特异性增加,过低则 引 物 扩增产物太少

  5. 反应体系对PCR扩增的影响 • pH值,盐离子浓度 • 稳定剂,增强剂 反应Buffer • 过高非特异性严重 • 过低无扩增产物 Mg 2＋浓度 • 浓度适当 • 避免反复冻融 dNTP Mixture • pH值适当 • 避免污染 ddH2O

  6. PCR标准反应体系 • DNA模板 • 引物 • 反应缓冲液 • Mg 2＋ • dNTP • ddH2O • 耐热聚合酶

  7. 如何选择最合适的DNA聚合酶 • DNA 聚合酶的特性 • PCR实验的不同需求

  8. 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性 纯 度 稳定性 酶活性

  9. 如何选择最合适的DNA聚合酶 －－ PCR实验的不同需求 特 异 性 基因组扩增、RT-PCR 保 真 性 基因筛选、测序、 基因克隆 长片段扩增 构建基因图谱、测序、分子遗传学 扩增效率 复杂模板扩增（GC含量高、二级结构） PCR试剂盒 复杂模板扩增、大规模基因检测

  10. － 热启动 Taq酶 特异性 原 理 特 点 用 途 • 蜡封 • 抗体抑制 • 化学修饰 • 避免非特异性扩增 • 提高PCR反应的 • 基因组扩增 • RT-PCR 特异性

  11. － 热启动 Taq酶 特异性

  12. — 高保真酶 保真性 原 理 用 途 • 3’－5’核酸 • 外切酶活性 • 降低碱基错配率 • 表达基因的克隆 • 基因的定点突变 • 细胞内基因点突变分析（SNP）

  13. — 高保真酶 保真性

  14. 高保真 ＋ 高扩增效率 原 理 用 途 • 混合酶 • －高扩增效率 • － 3’－5’核酸外切 • 超长片段扩增 －测序 －构建基因图谱 • 复杂模板扩增 －GC含量高 －二级结构

  15. 高保真 ＋ 高扩增效率

  16. PCRMasterMix 原 理 • 预配好的PCR反应液 • DNA聚合酶 • 反应缓冲液 • dNTP • PCR增强剂

  17. PCRMaster Mix 特 点 • 快速简便 减少加样误差和污染 • 灵敏度高可扩增低至2个拷贝的目的模板 • 特异性强 降低PCR反应的要求，增强特异性 • 稳定性好 长期放置活性无改变 适用范围 • 大规模基因检测 • 目的基因拷贝数极低的样本 • GC含量高,有二级结构的模板 • 复杂基因组样本 • 可直接检测菌落，基因点突变检测, 或者阳性克隆的筛选。

  18. PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略

  19. PCR常见问题 • 无扩增产物 • 非特异性扩增 • 拖尾 • 假阳性

  20. PCR常见问题之一 • 无扩增产物 • 现象：正对照有条带，而样品则无； 原因 • 模板:含有抑制物，含量低 • Buffer对样品不合适 • 引物设计不当或者发生降解 • 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短 • 纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量 • 更换Buffer或调整浓度 • 重新设计引物（避免链间二聚体和链内二级结构）或者换一管新引物 • 降低退火温度、延长延伸时间 对 策

  21. PCR常见问题之二 • 非特异性扩增 • 现象：PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

  22. PCR常见问题之二 • 非特异性扩增 原因 • 重新设计引物或者使用巢式PCR • 适当降低模板或引物浓度 • 适当减少酶量 • 降低镁离子浓度 • 适当提高退火温度或使用二阶段温度法 • 减少循环次数 • 引物特异性差 • 模板或引物浓度过高 • 酶量过多 • Mg2+浓度偏高 • 退火温度偏低 • 循环次数过多 对 策

  23. PCR常见问题之三 M 1 2 • 拖尾 • 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。

  24. PCR常见问题之三 • 拖尾 原因 • 模板不纯 • Buffer不合适 • 退火温度偏低 • 酶量过多 • dNTP、Mg2+浓度偏高 • 循环次数过多 • 纯化模板 • 更换Buffer • 适当提高退火温度 • 适量用酶 • 适当降低dNTP和镁离子的浓度 • 减少循环次数 对 策

  25. PCR常见问题之四 • 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) • 现象：空白对照出现目的扩增产物 • 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 • 对策： • 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； • 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 • 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

  26. PCR技术简介 PCR常见问题、原因分析及其解决方案 提高PCR反应特异性的策略 提高PCR反应特异性的策略

  27. 四种策略 • 巢式PCR（Nest-PCR） • 递减PCR（TouchDown PCR） • 热启动PCR（HotStart PCR） • 使用PCR增强剂

  28. 策略之一 P2 P4 P1 P3 • 巢式PCR（Nest-PCR） • 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 • 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5' RACE）的特异性。

  29. 策略之二 • 递减PCR（TouchDown PCR） • 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 • 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 • 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。

  30. 策略之三 • 热启动PCR （HotStart PCR） • 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR仪达到变性温度； • 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； • 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。

  31. 策略之四 • 使用PCR增强剂 • 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 • 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 • 增强剂浓度要适当

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