Организационные вопросы лабораторий молекулярно-биологических исследований

1. Организационные вопросы лабораторий молекулярно-биологических исследований Куевда Д.А., Шипулин Г.А. ФГУН «Центральный НИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора

2. Правила GLP (Good Laboratory Practice)

3. Условия получения качественных результатов анализа • A valid methodology – валидированная методология = «хорошие» тест-системы + соответвующее оборудование + правила работы (СОПы) • A quality assurance systems – «хорошая» лаборатория . • Trained and experienced analysts – обученный и опытный персонал. • A quality control system - система контроля качества.

4. Актуальные направления молекулярной диагностики ВИЧ-инфекции • Раннее выявление инфицированных детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей -ДНК ВИЧ(выявление) • Выявление инфицированных лиц в период «серологического окна», в т.ч. тестирование донорской крови РНК ВИЧ(выявление) • Мониторинг терапии РНК ВИЧ(вирусная нагрузка)

5. Новые направления молекулярной диагностики ВИЧ-инфекции • Определение устойчивости ВИЧ к антиретровирусным препаратам - РНК ВИЧ(секвенирование) • Определение генетической предрасположенности к непереносимости антиретровирусных препаратов – ДНК человека (выявление специфичных участков) Гиперчувствительность к Абакавиру – аллель hla B5701

6. Этапы проведения исследования молекулярно-биологическими методами Сбор Транспорт и хранение Пробопод-готовка ОТ и амплификация (ПЦР) Детекция Интерпретация результатов ТЕСТ-СИСТЕМЫ ОБОРУДОВАНИЕ МЕТОДОЛОГИЯ, ПРАВИЛА РАБОТЫ, СОПы ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРИИ ПЕРСОНАЛ N.B! Тонкие места анализа

7. Тонкие места анализа. Сбор, транспортировка и хранение • Для выявления и определения вирусной нагрузки ДНК HBV, РНК HCV и РНК ВИЧ используется только плазма крови (с ЭДТА, не сыворотка!) • Для определения мутаций устойчивости ВИЧ используется только плазма крови • Для выявления ДНК ВИЧ используютсяцельная кровь, лейкоциты крови (не плазма!) • Для выявления генетических предрасположенностей используютсяцельная кровь, лейкоциты крови Создание лабораторных регламентов и правил Работа с контрагентами лаборатории, обучение

8. Тонкие места анализа: тест-системы(пробоподготовка+ амплификация + детекция) • Следование инструкции к тест-системе • Соблюдение условий транспортирования и хранения • Сроки годности реагентов • Смешивание реагентов различных серий (?) • налаживание контроля и учета реагентов, система электронного документирования

9. Тонкие места анализа: оборудование • Вспомогательное оборудование (вортексы, центрифуги, термостаты, отсасыватели) • Весомый вклад в качество результата • Часто отсутствуют или ненадлежащего качества • Работа в ламинарных боксах (нарушение правил) • Отсутствие необходимого основного оборудования (e.gгельдокументирующая система) • Работа с персональным компьютером, «Интернет» • Владение английским языком • Экспертные консультации, обучение • Тщательный подбор персонала

10. Качество используемого оборудования Удовлетворительный прибор ОТРИЦАТЕЛЬНЫЕ образцы – «засветка» с соседнего канала флуоресценции, риск ложноположи-тельного ответа ПОЛОЖИТЕЛЬНЫЕ образцы Неудовлетворит-ый прибор Рез-ты iQ5, BioRad Тщательный подбор оборудования Апробации перед приобретением

11. Открытые или закрытые системы • Идеальное решение: открытое оборудование с клинически адаптированным программным обеспечением, позволяющим как выдавать формализованные результаты, так и самостоятельно произвести экспертную оценку (пересмотр) данных – должно быть разработано(!)

12. Сравнение цен

13. Тонкие места анализа: интерпретация результатов • Необходимость экспертных знаний для оценки результатов в том числе в случае использования закрытых систем с автоматической интерпретацией • Основные «болевые точки»: • Оценка данных ПЦР в реальном времени (определение вирусной нагрузки) • Оценка и редактирование последовательностей после секвенирования (определение мутаций устойчивости ВИЧ в АРВП)

14. Интерпретация результатов. Требования к точности количественных методов • Отличие измеряемой величины от истинной не более чем +/- 0,5 десятичных логарифма (lg) или в 3,2 разасчитается удовлетворительным • N.B! Логарифмконцентрации – показатель степени, в которую необходимо возвести 10, чтобы получить значение концентрации lg(1000) = 3 т.е. 103 = 1000, 100,5 = 3,2 • Все молекулярные методы логарифмические, то есть все расчеты (в т.ч. статистические) проводятся в логарифмах и лишь затем пересчитываются в значения концентраций

15. Интерпретация результатов генотипирования • чтение и редактирование полученной нуклеотидной последовательностив соответствие с рядом правил • умение работать с международными базами данных генотипов и фенотипов («виртуальное фенотипирование») (Stanford, Los-Alamos) через сеть «Интернет» • Проблемы: • Отсутствие знаний, навыков • Сложность обеспечения доступа в «Интернет» • Языковой барьер • Отсутствие системных данных о вариантах резистентности, присутсвующих на территории РФ

17. Проект российского он-лайн ресурса по резистентности ВИЧ к АРВП Задачи проекта: • Сбор оперативной информации о циркулирующих геновариантах ВИЧ в контексте устойчивости АРВП • Поиск новых мутаций устойчивости ВИЧ исходя из данных, полученных на территории РФ • Облегчение работы по интерпретации результатов • Внешний контроль качества

18. Документация :ПравилаGLP Правила=Стандартные Операционные Процедуры

19. Документация: для чего нужны СОП? Стандартные Операционные Процедуры (СОП) описываютвдеталяхвсе рутинные операции в лаборатории. Они необходимы в качестве дополнения к инструкции, если вы хотите, чтобы результаты исследований воспроизводились.В большинстве случаев СОПы содержат ответы на следующие вопросы:• Кто выполняет анализ?• Какой анализ выполняется?• При каких условия анализ может быть выполнен?• Где выполняется анализ?• Как анализ должен быть выполнен?

24. Условия получения качественных результатов анализа • A valid methodology – валидированная методология = «хорошие» тест-системы + правила их применеия + СОПы • A quality assurance systems – «хорошая» лаборатория . • Trained and experienced analysts – обученный и опытный персонал. • A quality control system - система контроля качества.

25. Действующий документ 1.3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ МЕТОДОМ ПЦР МАТЕРИАЛА, ИНФИЦИРОВАННОГО МИКРООРГАНИЗМАМИ I-II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 1.3.1794 – 03 Издание официальное Москва, 2003

26. Проект,2009 1.3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИЙ, ИСПОЛЬЗУЮЩИХ МЕТОДЫ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИЛОТ ПРИ РАБОТЕ С МАТЕРИАЛОМ, СОДЕРЖАЩИМ МИКРООРГАНИЗМЫ I-IVГРУПП ПАТОГЕННОСТИ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Москва, 2009

27. Требования к организации работ • 4.1 Исследование материала методами амплификации… связано с необходимостью одновременного обеспечения и соблюдения правил биологической безопасности и требований к организации и проведению данных работ с целью предотвращения контаминации нуклеиновыми кислотами исследуемых проб, помещений и оборудования/ • 4.3 Противоэпидемический режим в соответствие с СП 1.3.1285-03 (I-II группы патогенности) и/или СП1.3.2322-08 (III-IV группы патогенности)

28. Специальные требованияк организации ПЦР-лаборатории связаны с механизмом ПЦР

29. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ

30. Контаминация продуктами амплификации – одна из главных проблем ПЦР-лаборатории !

31. Причина контаминации – попадание продуктов амплификации в окружающую среду при открывании пробирок после амплификации.

32. Следствие контаминации – появление артефактов ДНК диагностики

33. Факторы, способствующие контаминации ПЦР-лаборатории • Использование методов детекции ПЦР-продуктов, включающих открывание амплификационной пробирки (секвенирование, электрофорез) • Неправильная организация ПЦР-лаборатории. • Неправильное поведение лабораторного персонала.

34. Основныепринципы организации ПЦР-лаборатории • Разделение лаборатории на 4 рабочих зоны: • I. Прием, маркировка, регистрация материала, первичная подготовка, аликвотирование • II. Очистка нуклеиновых кислот • III .Подготовка смесей и проведение ОТ и амплификации • IV. Детекция • Полное исключение физического сообщения между 4-й и 1,2,3 –й зонами (персонал не перемещается между зонами!) • Активные мероприятия, направленные на выявление контаминации и ее устранение.

35. План лаборатории молекулярной диагностикииспользующей МАНК с электрофоретической и ГИФА детекцией продуктов Зона 4. детекция Вспомогательные помещения Зона 1. регистрация, первичная обработка Зона 2. выделение НК Зона 3. Амплификация

36. Технология амплификации в реальном времени и контаминация • Пробирки с продуктами реакции не открываются –риск контаминации резко снижен • НО! Риск контаминации сохраняется в связи с наличием вероятности случайного открывания пробирки после реакции, следовательно: • Желательна отдельная комната для амплифкации • Постоянный контроль лабораторной контаминации

37. План лаборатории молекулярной диагностикииспользующей МАНК с флуоресцентной детекцией Зона 3а. Подготовка смесей Зона 3b. Амплификация Вспомогательные помещения Зона 1. регистрация, первичная обработка Зона 2. выделение НК

38. Требования к лаборатории, проводящей секвенирование(оределениерезистентности ВИЧ к АРВП) • Проведение секвенирования – работа со сверхконцентрированными образцами ДНК (ампликонами) – должна проводиться в зоне 4 • Реакция секвенирования чувствительна к загрязнениям и примесям • В пределах 4 зоны для постановки реакции должна быть выделена отдельная комната (зона 4b) • Постановка реакции секвенирования должна осуществляться в ламинарном шкафу 2 класса

39. План лаборатории молекулярной диагностикииспользующей МАНК с ЭФ, ГИФА детекцией продуктов и проведением секвенирования Зона 4а. Детекция ЭФ, ГИФА Зона 4b. чипы, секвенирование, Вспомогательные помещения Зона 1. регистрация, первичная обработка Зона 2. выделение НК Зона 3. Амплификация

40. + + + Приточно-вытяжная вентиляция должна быть устроена отдельно для I, II, III идля IVзоны Пре-ПЦР ПЦР Пост-ПЦР - -  - -  коридор Для удаления пыли эффективно использование принудительной фильтрации воздуха через HEPA-фильтры.

41. Мероприятия, направленные на выявление контаминации – смывы в лаборатории (п. 8.10) • Позволяют выявить факт контаминации лаборатории до появления ложно-положительных результатов, провести контроль деконтаминации • Периодичность: 1-4 раза в месяц, после деконтаминации • Случаи контаминации регистрируют в спец. журнале • Правила: • смоченный в ТЕ-буфере ватный зонд проводится по рабочим поверхностям лаборатории (10-15 секунд) • Зонд погружается в 400 мкл ТЕ-буфера, отжимается и выбрасывается, суспензию центрифугируют • Полученный раствор исследуют методом ПЦР с внутренним контролем

42. Система обеспечения качества • Мониторинг условий сбора, хранения, транспортировки, предобработки клинического материала, постановки ПЦР и реакции секвенирования • Качество работы оборудования (в первую очередь амплификаторов).

43. Прибор для поверки точности поддержания температурного режима амплификаторов - СМТ-8 • Точность ± 0.1 °С • Количество каналов - 8 • Измерение в реальном времени • Пробирки - 0.2 ml and 0.5 ml

44. Результаты измерения температуры исправного амплификатора

45. Результаты измерения температуры неисправного амплификатора

46. Результаты амплификации при неверной настройке прибора для ПЦР в реальном времени (iQ5, BioRad) «Инвертированные» кривые - ?

47. Условия получения качественных результатов анализа • A valid methodology – валидированная методология = «хорошие» тест-системы + правила их применеия + СОПы • A quality assurance systems – «хорошая» лаборатория . • Trained and experienced analysts – обученный и опытный персонал. • A quality control system - система контроля качества.

48. Задачи обучения персонала лаборатории • Получение знаний о принципах, лежащих в основе молекулярных методов диагностики • Знакомство с практическим применением молекулярных методов в клинической практике • Обучение практическим навыкам работы в лаборатории молекулярных методов • Обучение экспертной оценке данных

49. Снижает ли использование «закрытых» систем требования к обучению персонала? Результаты ФСВОК, цикл вирусная нагрузка ВИЧ, 2008 год: • Неудовлетворительные результаты – 25% • Лаборатории использующие «закрытые» системы – 26% • Лаборатории, использующие «открытые» системы – 23%

50. Лицензия на право образовательной деятельности ФГУН «ЦНИИ Эпидемиологии» Роспотребнадзора