茶园土壤微生物群落结构变化动态的研究

农业生物资源研究所 茶园土壤微生物群落结构变化动态的研究报告人：苏远科指导老师: 刘波研究员

农业生物资源研究所 论文概述研究意义研究内容技术路线结论分析

农业生物资源研究所 论文概述磷脂脂肪酸 (phospholipid fatty acid，PLFA)图谱分析，在微生物群落动态分析上的应用十分广泛。磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5％。在细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代谢掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动态监测。另一个重要因素是脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生物分类的依据。磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。群落的微生物结构发生变化，即可以通过谱图的变化得到快速有效的监测。本文就是利用PLFA图谱分析研究安溪不同树龄，海拔高度，季节的茶园土壤微生物群落动态变化，从而对安溪茶园土壤微生物群落结构及变化有一定的了解，对茶园生态建设提供理论指导。

农业生物资源研究所 研究意义 • 安溪乌龙茶全国文明，茶香，茶色，茶味，都有独到之处，形成如此优良的品质和当地自然环境包括地理水文光照土壤等是分布不开的，在这种独特的环境中一定也孕育着独特的土壤微生物群落。茶园土壤微生物群落作为一种指标反映茶园土壤及茶树生长状况。对茶园生态建设有一定的指导意义。 • 目前在国内还很少人利用磷脂脂肪酸图谱分析对茶园土壤微生物群落进行研究。所以本文应用PLFA分析法对不同树龄，海拔，季节的茶园土壤微生物群落变化动态进行比较系统的研究，有一定理论意义和实用价值。

农业生物资源研究所 研究内容从安溪感德和西平两地，根据不同季节，不同树龄，不同海拔采集茶园土样。进行土壤磷脂脂肪酸提取及测定。通过聚类分析主成分分析等统计学方法对磷脂脂肪酸图谱分析来研究茶园土壤微生物群落在不同季节，海拔高度，及不同树龄情况下茶园土壤微生物群落动态变化及差异。

农业生物资源研究所 技术路线土样采集地点选择土样采集和保存土样磷脂脂肪酸提取和测定测量数据处理和汇总不同海拔高度茶园土壤磷脂脂肪酸分析不同树龄茶园土壤磷脂脂肪酸分析不同季节茶园土壤磷脂脂肪酸分析

农业生物资源研究所 磷脂脂肪酸提取方法及步骤碱裂解与甲脂化脂肪酸提取GC分析中和脂肪酸萃取 KOH甲醇溶液和4g的新鲜土样加到50ml的离心试管中，混合均匀在37℃下温育1h(脂肪酸释放，并甲脂化，样品10min涡悬1次) 加入3ml 1.0mol/L的醋酸溶液中和pH值，充分摇匀。加10ml正己烷，使磷脂脂肪酸（PLFA）转到有机相中，800r/min离心，将上层正己烷转到试管中，在N2气流下挥发掉溶剂用1ml体积比为1:1的正己烷:甲基丁基醚溶液溶解,用作GC分析。

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析土样采集时间地点及生境类型

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析图2 不同海拔茶树根际土壤细菌，真菌，放线菌特征性磷脂脂肪酸标记含量的变化

农业生物资源研究所 20:00 20:1ω9C a 17:1ω9C 10Me18:0 12:0 3OH 13:0 2OH 15:0 3OH i15:1 G 16:1 2OH 17:00 10 Me 17:0 i17:0 3OH 18:0 2OH 19:0 10 Me 14:1ω5C 16:0 N ALCOHOL i15:0 3OH i15:1 F 17:0 CYCLO 12:00 14:00 18:3ω6C (6,9,12) 15:0 cy19:0ω8C i16:0 17:0 A 18:00 16:0 10Me 16:00 18:1ω9C i15:0 16:1ω5C i17:0 16:0 A 18:1ω7C 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析类型一其特征为磷脂脂肪酸生物标记为不完全分布且分布量低类型二其特征是磷脂脂肪酸生物标记完全分布、在各海拔平均分布量较高

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析当欧氏距离为10左右时，可将不同海拔茶园的磷脂脂肪酸生物标记分成两个大的类群。类型Ⅰ包括脂肪酸标生物标记20:00、20:1ω9C 、a17:1ω9C、12:00、10Me 18:0、12:0 3OH、13:0 2OH、14:00、14:1ω5C、15:0 3OH、i15:0 3OH、i15:0F、i15:1 G、16:0 N ALCOHOL、16:1 2OH、17:00、10Me 17:0 、cy17:0、i17:0 3OH、18:0 2OH、18:3ω(6,9,12)、10Me 19:0，其特征为磷脂脂肪酸生物标记为不完全分布且分布量低；类型Ⅱ包括磷脂脂肪酸生物标记a15:0、i15:0、16:00、10Me 16:0、a16:0、i16:0、16:1ω5C、a17:0、i17:0、 18:00、18:1ω7C、18:1ω9C、cy19:0ω8C，其特征是磷脂脂肪酸生物标记完全分布、在各海拔平均分布量较高

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析不同海拔茶园土壤PLFAs丰富度及均匀度分析 Simpson(J)、Shannon(H)、BRILLOUIN、McIntosh(Dmc)多样性指数之间的相关系数大于0.90,表明这几个指数的互换性较高，选择其中一个就行。特征值分析结果表明，选择第一主成份，含有总体信息量的93%。从主成分分析因子得分可知，影响第一主成份的主要因素是Simpson(J)（得分0.81）和均匀度（得分0.10）因而，微生物群落多样性指数的分析可以使用Simpson(J)和均匀度。

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析图 4 不同海拔茶树根际土壤微生物群落shannon多样性指数 shannon指数则较多反映群落中常见的物种，从图四可见，海拔800米处的茶树根际土壤的Shanon指数3.84明显高于海拔500米的3.59、600米的3.54和700米的2.81，说明海拔800米处茶树根际土壤中的微生物丰富度高于其它3个海拔处茶树根际土壤的微生物，而500米和600米海拔的茶树根际土壤微生物丰富度相当，700米海拔的茶树根际土壤微生物丰富度较低；

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析图 5 不同海拔茶树根际土壤微生物群落均匀度指数从均匀度指数看，海拔600米茶树根际土壤均匀度指数最高，其次是海拔800米的茶树根际土壤，接下来是海拔500米的茶树根际土壤，而海拔700米的茶树根际土壤均匀度指数最低。均匀度是微生物组成和分布量的综合体现，不同海拔茶树根际土壤均匀度的明显差异说明，各海拔茶树根际土壤的微生存在丰富的多样性。

农业生物资源研究所 不同海拔高度茶园土壤微生物PLFAs生物标记分析结论分析各海拔茶树根际土壤PLFAs总量800米海拔最大，700米最小。细菌脂肪酸标记16:0 相对生物量在海拔800米处为最高值，海拔800米处（16291）>海拔500米处（7733）>海拔600米处（7165）>海拔700米处（4994）。真菌脂肪酸标记18:3ω6c(6,9,12)的相对生物量大小依次为：海拔600米处（1210）>海拔500米处（1067）>海拔800米处（648）>海拔700米处（0）。从以上丰富度指数和均匀度指数看海拔800米茶树根际土壤微生物种类最多，海拔700米的茶树根际土壤微生物种类最低。海拔600米茶树根际土壤均匀度指数最高，其次是海拔800米的茶树根际土壤，接下来是海拔500米的茶树根际土壤，而海拔700米的茶树根际土壤均匀度指数最低。

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究土样采集时间地点及生境类型

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究图7. 5月份不同树龄茶树根际土壤细菌磷脂肪酸标记C16:00比较图6. 5月份不同树龄茶树根际土壤微生物磷脂脂肪酸标记总量比较

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究图8. 不同树龄茶树根际土壤真菌磷脂脂肪酸标记18:1ω9c及18:3ω6c(6,9,12)比较图9. 不同树龄茶树根际土壤放线菌磷脂脂肪酸标记10Me18:0比较

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究对不同土样整体做聚类分析欧氏距离6左右区分茶园土壤和对照及原始林地土壤

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究类群一含量平均在1500-2000比较少但是较稳定类群二含量平均在3000-3500比较丰富幻灯片 23类群三含量最丰富均在5500-7000 幻灯片 24类群四含量最少，少于1000且变化较大

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究通过spss对上表格差异显著性分析发现类群2的脂肪酸标记差异是显著。P＜0.05，且与树龄正相关既是类群二的磷脂脂肪酸标记随着树龄增大而增大。

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究不同树龄茶园土壤中两类不同趋势的脂肪酸标记

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究随着树龄有递增趋势的几种磷脂脂肪酸生物标记4、8、15分别代表不同树龄的茶园土样

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究不同树龄茶园土壤中几种随着树龄先增加后减少趋势的脂肪酸生物标记

农业生物资源研究所 茶树树龄对茶园土壤微生物群落影响研究结论与分析不同树龄茶园土壤微生物磷脂脂肪酸标记与树龄有极显著相关性(p<0.05)，随着树龄增长4年到8年15年茶园土壤微生物的总量有所增加但是这种增长趋缓。有文章称茶树生长超过50年土壤微生物总量会下降其中细菌的增加是对磷脂脂肪酸总量贡献最大，真菌和放线菌的磷脂脂肪酸标记含量是先增长后减少。发现14:00、a15:0细菌生磷脂脂肪酸特征性物标记，16:00假单胞杆菌磷脂脂肪酸生物标记a16:0、i16:0革兰氏阳性性细菌磷脂脂肪酸生物标记cy19:0ω8c、伯克霍尔德菌生物标记，随着树龄有递增趋势。而一部分例如10Me 18:0是放线菌磷脂脂肪酸生物标记，18:1ω7C是厌氧细菌磷脂脂肪酸生物标记，18:1 ω9c、18:3ω6c(6,9,12) 真菌磷脂脂肪酸特征性生物标记，18:00嗜热解氢杆菌磷脂脂肪酸特征性生物标记，cy17:0 、i17:0革兰氏阴性细菌磷脂脂肪酸特征性生物标记。随着树龄增加先增加后减少的趋势。还有一部分变化不明显。

农业生物资源研究所 季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究土样采集时间地点及生境类型

农业生物资源研究所 季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究不同月份茶树根际土壤微生物脂肪酸标记总量PLFAs比较 1、2、3分别代表树龄4年8年和15年的茶园土壤，ck没有种植茶树的梯田壁上的土壤，504代表未开发的原始林地土壤。

农业生物资源研究所 季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究图 13不同月份茶树根际土壤细菌磷脂肪酸标记C16:00比较 1、2、3分别代表树龄4年8年和15年的茶园土壤，ck没有种植茶树的梯田壁上的土壤，504代表未开发的原始林地土壤。

农业生物资源研究所 季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究图 14不同月份茶树根际土壤真菌磷脂脂肪酸标记18:1ω9c及18:3ω6c(6,9,12)比较 1、2、3分别代表树龄4年8年和15年的茶园土壤，ck没有种植茶树的梯田壁上的土壤，504代表未开发的原始林地土壤。

农业生物资源研究所 季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究图 15不同月份茶树根际土壤放线菌磷脂脂肪酸标记10Me18:0比较

农业生物资源研究所 季节变化对茶园土壤微生物群落影响研究结论分析不同季节土壤微生物群落变化很大，在8月份土壤微生物的总量和种类都是最多的，脂肪酸总量8月分是其他月份的2~3倍。从脂肪酸标记量数目看8月份平均在43个左右其他几个月份脂肪酸数目在20~25，也就是说8月份微生物量是最多，最丰富。这与前人研究一致。在夏季土壤湿润，光照充足，土壤中的有机质分解比较快，土壤营养比较充沛，造成土壤微生物活动旺盛，繁殖迅速。所以土壤中微生物数目多且种类丰富。通过显著性分析不同月份脂肪酸数据差异显著p＜0.01

农业生物资源研究所 感谢各位专家提出宝贵意见

茶园土壤微生物群落结构 变化动态的研究