水产动物疾病学实验

1. 水产动物疾病学实验 • 实验目的与任务： • 本实验课程的教学旨在学生掌握水产动物疾病学的基本原理和基本技术，主要包括水产物疾病学的典型症状和诊断的一般方法。在教学基本理论和方法的基础上动，加强与生产实际相联系，引进一些最新技术扩大学生的知识视野。注重培养学生分析问题和解决问题的能力以及严格的科学作风，使学生具备从事水产动物疾病学研究和为水产业服务的过硬本领。 • 本实验的任务是培养学生掌握水产动物疾病学中病毒、细菌、真菌、藻类、寄生虫和非寄生性疾病的典型症状及区别，疾病诊断的方法与步骤，疾病防治的方法。

6. 水产动物疾病学实验 • 实验教学基本要求： • 1、运用所学的《水产动物疾病学》等理论课中的概念和理论知识来指导实验，并通过实验获得相关的感性知识，从而更进一步地巩固所学的理论课知识。 • 2、熟练地掌握水产动物疾病学实验的基本操作与基本技能，通过仔细观察和相互比较来熟悉水产动物常见疾病的主要症状、危害程度及流行情况；掌握水产动物疾病诊断的常规步骤与方法；了解主要疾病病原体的生物学与生态学特征及生活史等；了解水产常见药物的药理与使用方法；熟悉水产动物疾病大类的预防与治疗方法。 • 3、按实验指导书上所述方法，在完成相关的实验操作后，通过观察、分析能认真仔细地独立撰写实验报告；并通过理论与实践知识的累积，不断提高自子解决问题的能力和实际动手操作能力。 • 4.要求课前，弄懂进行预习实验目的和原理，熟悉内容和步骤，写出相应的预习报告。

7. 实验项目 • 实验一 疾病常规检查方法与诊断 • 实验二 病毒疫苗土法制备安全及效率试验 • 实验三 虾蟹类病毒性疾病的观察 • 实验四 细菌性鱼病活体或病变标本的观察（一） • 实验五 细菌性鱼病活体或病变标本的观察（二） • 实验六 虾蟹类细菌性疾病的观察（一） • 实验七 虾蟹类细菌性疾病的观察（二） • 实验八 真菌性、藻类性疾病及病原体的观察 • 实验九 纤毛虫、鞭毛虫类的观察 • 实验十 孢子虫、吸虫类的观察 • 实验十一 绦虫、线虫类的观察 • 实验十二 甲壳动物病病原体的观察

8. 实验一 疾病常规检查方法与诊断 • 一、实验目的 • 通过对本实验课的学习，了解常规的肉眼检查和显微镜检查疾病的方法，对检查结果进行分析、比较，进行疾病诊断 • 二、实验材料、仪器 • 活的或刚死的病鱼，显微镜、介剖镜、介剖盘、介剖剪、介剖刀、镊子、吸管、载玻片、盖玻片等 • 。

9. 三;疾病检查与诊断程序 • １基本情况 • ２体表检查 • ３体内检查 • ４根据检查情况进行初步诊断 • ５病原体确定进行确诊。

10. 四、实验方法 • 一、基本情况调查： • 水质情况、吃食情况、用药情况、发病情况等。 • 二、肉眼检查； • （1）体表：大型寄生虫、发炎、充血、腐烂、体色变化等； • （2）体内器官：大型寄生虫、发炎、充血、腐烂、器官色素变化等。 • 三、显微检查： • 病灶部位和可疑部位取样制片在显微镜、介剖镜下检查。

19. 五：病原体检查 • 1病原体分离与培养： • 2pcR仪器检测病原体： • 3酶联体检测病原体：

20. 六　疾病诊断 • １：疾病诊断是一个复杂的．综合的分析判断过程，它是根据环境条件，发病对象，发病季节，发病症状与表现，病原体确定等因素做出的综合分析判断结果。 • ２：疾病诊断是确定引起疾病发生的主要原因，疾病过程与发病机理。

21. 疾病诊断 • ３：疾病诊断方法 • （１）根据症状诊断 • （２）根据病原体诊断 • （３）综合诊断

24. 作业一 • １疾病检查的一般程序？ • ２疾病诊断的方法？正确诊断的意义？

25. 实验二：病毒疫苗土法制备 一、实验目的 • 1.了解土法疫苗免疫的原理，掌握其制备方法和注射方法（或了解细菌性灭活疫苗制备的基本过程）。 • 2.掌握草鱼出血性病毒疫苗制备（或组织浆灭活疫苗制备）的基本过程。 • 二、仪器设备 • 1.解剖工具（剪刀、镊子）、台秤（天平）、组织打浆机或匀浆机（或研钵）、水浴锅、温度计、注射器、量筒、三角锥瓶、漏斗、水壶； • 2.剪刀、天平、蔡氏过滤器、塑料微型滤器、冰箱、液氮罐、离心机。

26. 三、实验材料 • 1.患草鱼三大病（赤皮、肠炎、烂鳃病）的草鱼，最好是三大病并发的濒死或刚死不久的草鱼； • 2.患典型出血病的濒死或刚死不久的草鱼。 • 四、实验药品 • 1.甲醛、生理盐水、70%的酒精； • 2.青霉素、链霉素、生理盐水、70%的酒精、50%缓冲甘油、PBS液、Earle培养液。

27. 五、实验内容 • 1.病毒材料收集与保存 • （1）无菌操作收集，病毒不灭活，材料标本不能在太阳下曝晒，要在阴暗低温处； • （2）用发病早期的鱼（典型出血病），不用已经死亡的鱼，用水冲洗体表，再用70%的酒精消毒体表，然后才取出肌肉、内脏，随即放入50%缓冲甘油内保存，写好标签（地点、寄主、日期），野外收集最好用冰壶带回，保存在-20℃或5℃冰箱内。

28. 2.活苗的制备 • 无菌操作取出病灶（肌肉、内脏组织），称重后剪碎，加10倍无菌生理盐水，匀浆，3000～3500转/分低温离心30分钟，取上清液，加青霉素1000IU/mL，链霉素1000μg/mL，混匀，再在4℃下过夜除菌后即为病毒悬液。

29. 2.灭活 • 加入福尔马林，使成0.1%浓度，摇匀后，置于32℃恒温水浴锅灭活72小时。 • 化学灭活：以福尔马林作为化学灭活剂。灭活前先确定福尔马林对该病原菌的安全灭活浓度，确定方法为：取 7 支灭菌试管，分别 5ml 加入预先制备病原菌菌液，其中 6 支装有菌液的试管分别依次加入一定量的福尔马林，使福尔马林的终浓度分别为 0.1% 、 0.2% 、 0.4% 、0.6% 、0.8% 、1.0% ，另 1 支试管不加入福尔马林作为对照；于 4 ℃ 下放置 24h 后，于每支试管中分别取 0.2ml 菌液于 2216E 琼脂平板上涂布， 28～30 ℃ 下培养 48h ，检测各试管内细菌的存活情况，只有没有细菌生长的对应福尔马林浓度才是该病原菌的灭活安全浓度。向第 1 步中制备的 1% 菌悬液内添加福尔马林，使福尔马林的最终浓度达到安全灭活浓度以上，于 4 ℃ 下放置 24h ，制备灭活菌液。

30. .安全和效力试验 • （1）安全性检测 • 活性检测：取 0.2ml 灭活菌于 2216E 琼脂平板上涂布， 28～30 ℃ 下培养 48h ，只有在琼脂平板上没有出现菌落出现才说明灭活彻底，灭活菌液中确实没有活菌存在。 • 安全检测：将所制备的灭活菌液稀释成疫苗接种所用的浓度（一般为10 8 cfu），用注射法将稀释后的灭活菌液接种到无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，经20d 观察无发病或死亡才说明该灭活细菌是安全的

31. 攻毒感染实验：选择 无患病史的同种同龄寄主动物（水产养殖动物）作为感染对象，用注射法进行攻毒感染。 用注射法将稀释后的灭活菌液接种到 无患病史的同种寄主动物（水产养殖动物）体内，连续养殖 2 个月，从第 20d 开始每隔 20d 取 10 尾以上接种生物用 活的病原菌进行感染，感染方法为： 。 • 4.保存 • 石蜡封瓶口，贴上标签， 4～8℃冰箱中密封保存。 • 5.注射 • 腹腔注射，每尾0.1～0.2mL

32. （2）效果检测 • 抗体效价检测：用注射法将稀释后的灭活菌液接种到 无患病史的同种寄主动物（水产养殖物）体内，连续养殖动 2 个月，从第 10d 开始每隔 10d 取 3 尾以上接种生物用 微量血凝板法检测其平均凝集抗体效价。抗体效价检测方法为：抽取感染动物血液并离心分离血清，用取样器吸取 0.1ml 血清加入经灭菌的 96 孔板的 A1 孔内，在 96 孔板 A 行的其他孔内加入 0.05ml 无菌 PBS ，从 A1 孔内取 0.05ml 血清加入 A2 孔内，混匀后再从 A2 孔内取 0.05ml 液体加入 A3 孔内 ……，如此重复，使 96 孔板内后 1 个孔内的血清浓度均比前 1 个孔低 1 倍（倍释法），再在 96 孔板的每个孔内加入 0.05ml 菌液（活的或灭活的均可），37 ℃ 孵育过夜后观察（最好在 96 孔板下垫一张黑纸以增加反差），出现沉淀的最高血清稀释倍数即为血清中所含抗病原菌抗体的效价。比较不同时期内抗体效价的变化情况，确定最高抗体效价值。一般情况下，抗体效价越高，灭活细菌作为疫苗的效果就最好。

33. 4.免疫注射方法 • 取土疫苗若干，加生理盐水1倍稀释摇匀后备用。将要免疫注射的鱼放在0.2%～0.25%浓度（50千克水中加入100克～125克晶体敌百虫）的敌百虫溶液中浸泡3分钟～5分钟，使鱼儿暂时处于麻醉状态。然后在其背鳍基部后端无鳞处肌肉注射或在腹鳍基部进行腹腔注射。注射剂量依鱼体大小而定，10厘米～13厘米的草鱼，每尾注射0.1毫升；14厘米～16厘米的鱼，每尾注射0.2毫升；20厘米以上的鱼每尾注射0.3毫升～0.5毫升。

34. 实验三：虾蟹类病毒病的简易诊断 • 一、实验目的 • 通过对虾蟹病毒病的病变标本观察，掌握虾蟹病毒病的主要可见症状，了解虾蟹病毒病流行情况和危害性，掌握虾蟹类病毒病的简易诊断方法。 • 二、实验用具 • 解剖工具（小镊子、小剪刀、解剖针）、显微镜、载玻片、盖玻片、、擦镜纸等。 • 三、实验材料药品 • 患病毒病虾类的活体标本和固定标本，0.1%孔雀绿溶液。

35. 四、实验内容： • 1、患病毒病虾的活体标本和固定标本的可见症状观察： • （1）先将活体虾小型透明容器内，加水观察虾的附肢、甲壳变红，有无粘附物，有无黑色、白色、黄色褐色等斑块；肝胰脏是否肿胀或变浊发白；腹部肌肉是否变浊。并做好纪录。 • （2）再在解剖盘中观察活体虾、固定标本（1）的内容。做好两种标本的观察纪录并作比较。

36. 2、患病毒病虾的活体标本的光学显微观察： • （1）虾类肝胰脏的获取：去掉虾的头胸甲，用解剖针小心拨开虾体头顶部的肝胰脏团（黄褐色），再用镊子取一小块肝胰脏。 • （2）在载玻片滴一滴0.1%孔雀绿溶液，用盖玻片压成薄片，几分钟后在高倍镜观察有无蓝绿色的核内较大的包函体，每人观察3-5个压片。做好纪录。 • 3、根据1、2观察结果，作出虾病的初步诊断。

43. 五、思考题 • 1.对虾白斑杆状病毒病与对虾中肠腺坏死病毒病症状有何区别？ • 2.虾类细菌性疾病是否用此方法看到核内较大的包函体，为什么？

44. 实验四 鱼类细菌性疾病 • 一、实验目的 • 通过对患细菌性病病鱼活体和固定标本及病原体的观察，掌握鱼类细菌性体表疾病的主要症状和病原体的形态特征，了解常见鱼类细菌性体表疾病流行情况和危害性，掌握其诊断方法和防治方法；为今后诊断传染性疾病打下基础。 • 二、实验用具 • 解剖工具（小镊子、小剪刀、解剖针）、解剖镜、显微镜、载玻片、盖玻片、纱布、擦镜纸、酒精灯、皮管、火柴等。

45. 三、实验材料药品 • 草酸铵结晶紫液或品兰、革兰氏碘液、番红液或曙红、95%酒精、0.85%生理盐水、蒸馏水。.烂鳃、赤皮病、疖疮病等鱼类患病活体标本和固定标本

46. 四、实验内容 • （一）病变标本观察 1.烂鳃病观察：肉眼观察病鱼头部颜色特别暗黑，鳃丝腐烂发白，常粘有许多污泥，严重时鳃丝尖端软骨外露，鳃盖骨内 表皮充血，中间部分表皮被腐蚀成一个小洞，从外表看像透明天窗。 • 2.赤皮病的观察：主要病变是病鱼体表部分或大部分出血，发炎、鳞片脱落，特别在鱼体俩侧，更为明显，鳍基部充血，鳍条腐烂。 • 3.疖疮病的观察：主要病变是病鱼鳍条腐烂，体表、鳍基充血，体色变黑，特别在鱼体俩侧上部有疖状隆起，隆起处内部肌肉腐烂，但鳞片不脱落（疾病中期前） • 4.上述观察做好纪录。

47. （二）病原体的观察 • 1.活体观察烂鳃病的病原体柱状嗜纤维菌，用载玻片进行高倍镜或油镜观察细菌活体的运动和菌体形态特征。 • 2.固定染色观察：细菌可用镜检作活体检查，但由于体积很小，胞质透明，细胞结构不易辨别，用革兰氏染色根据细菌对染料的不同反应，可区分细菌为两大类，即阴性和阳性。

48. 六、思考题 • 1.鱼类细菌性体表疾病有哪些共同症状？ • 2.烂鳃、疖疮病、赤皮病病变的主要特征是什么？

49. 实验五 ： 虾蟹类细菌性体表疾病 • 一、实验目的 • 通过对蟹类细菌病的疾病活体标本观察，掌握虾蟹细菌性疾病的主要可见症状，了解流行情况和危害性，掌握虾蟹类细菌病的防治方法。 • 二、实验用具 • 解剖工具（小镊子、小剪刀、解剖针）、解剖镜、显微镜、载玻片、盖玻片、、擦镜纸等。 • 三、实验材料药品 • 患细菌性疾病蟹的活体标本和固定标本，染色液。

50. 四、实验内容： • 1、患细菌性疾病蟹的活体标本和固定标本的可见症状观察： • （1）再在解剖盘中观察患细菌性疾病病蟹活体，观察蟹的附肢及甲壳，有无粘附物，有无黑色、黄色、黄褐色等斑块；鳃是否肿胀或发白、发黄、变黑色；肠道是否变黑。并做好纪录。 • （2）、固定标本（1）的内容。做好两种标本的观察纪录并作比较。 • 2、病原体显微观察： • 取病蟹鳃或肠道病变组织小片，在载玻片滴一滴染料溶液，用盖玻片压成薄片，几分钟后在高倍镜观察有无活动的菌体，每人观察3-5个压片。做好纪录。 • 3、根据1、2观察结果，作出蟹病的初步诊断。