Buchtíková S., Hyršl P., Dušková M.

1. Stanovení bakteriolytické aktivity komplementu u různých druhů obratlovců metodou bioluminiscence Buchtíková S., Hyršl P., Dušková M. Oddělení fyziologie a imunologie živočichů, Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Kotlářská 2, Brno 611 37, Česká republika; E-mail: 85064@mail.muni.cz ÚVOD: Komplementový systém je humorální složka nespecifické imunity typická pro obratlovce. Je to soubor přibližně 30 sérových proteinů, které mohou být volné nebo membránově vázané. Jednotlivé proteiny se v séru a plasmě vyskytují v inaktivní formě, avšak specifický signál způsobuje aktivaci první složky, která spouští kaskádu reakcí vedoucích k aktivaci složek následujících. Konečným výsledkem kaskády je sestavení terminálního komplexu MAC (membrane attack complex), který vytváří póry v membráně cílové buňky a způsobuje tak její poškození a lyzi. Komplement může být aktivován cestou klasickou (vyžadující protilátku vázanou k povrchu patogenu), alternativní (aktivována povrchovými molekulami patogenu) nebo lektinovou. Lektinová cesta je spuštěna živočišnými lektiny a je typická pouze pro savce, u ryb definována nebyla. Mezi nejdůležitější funkce komplementu patří bakteriolytická aktivita (zejména proti G- bakteriím), účast při regulaci zánětu, opsonizace cizorodých částic, čímž je usnadněna jejich fagocytóza. Cílem je optimalizace této metody pro porovnání aktivity komplementu u vybraných druhů obratlovců a srovnání aktivity klasické a alternativní cesty. VÝSLEDKY A DISKUSE: Při optimalizaci stanovení bakteriolytické aktivity komplementu u použitých živočišných druhů byly sledovány podmínky, které tuto aktivitu ovlivňují. Byla to jednak různá teplota inkubace, délka inkubace a optická hustota bakterií. Kapr: Aktivita komplementu kapří plasmy (séra) při 30°C, délka inkubace 3 hod. Z výše uvedených grafů je patrné, že bakteriolytická aktivita séra je vyšší než plasmy (dochází k výraznějšímu poklesu viability bakterií). V případě séra je klasická cesta účinější než alternativní, v případě plasmy je tomu naopak. Myš: Různá délka inkubace reakční směsi (na obrázku vlevo 3 hod., na obrázku vpravo 17 hod., v obou případech teplota inkubace 37°C) může pozitivně ovlivňovat aktivitu komplementu. Otázkou však zůstává jestli pokles viability bakterií při dlouhodobé inkubaci není způsoben absencí růstového média. V obou případech byla aktivita klasické cesty vyšší než alternativní. Morče: V případě morčecího séra byly použity dvě různé optické hustoty bakterií, teplota inkubace 20°C. Experiment vlevo znázorňuje aktivitu komplementu při použití bakteriální suspenze o optické hustotě 0,54; vpravo byla použita suspenze o optické hustotě 0,25. Účinnost komplementu je vyšší v případě bakterií s menší optickou hustotou. Jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících aktivitu komplementu je teplota. Na příkladu tohoto grafu lze demonstrovat, že morčecí sérum při teplotě 37°C zvyšuje účinnost komplementu oproti 20°C (viz předcházející dva grafy). To je patrně spojeno s faktem, že při teplotě 37°C a vyšší dochází k aktivaci imunitního systému. Člověk: Na příkladu lidské plasmy jsou zobrazeny hodnoty bioluminiscence (vlevo) a výsledný přepočet na viabilitu bakterií jako v předchozích případech (vpravo). MATERIÁL: Ke stanovením byla použita krevní plasma nebo sérum kapra, myši, morčete a člověka. Krev kapra obecného (Cyprinus carpio) byla odebrána z kaudální žíly. Část krve byla ponechána do druhého dne při 4°C k vysrážení. Poté bylo sérum odděleno centrifugací při 1500 x g / 10 min. Krevní plasma byla připravena smícháním krve s heparinem o výsledné koncentraci 50U / 1 ml krve a oddělena následnou centrifugací při 1500 x g / 10 min. Krev laboratorních myší (BALB/c) byla odebrána v narkóze z krční tepny a zpracována na plasmu a sérum stejným způsobem jako v případě kapří krve. Morčecí sérum určené ke stanovení komplementu bylo dodáno firmou Bioveta, Ivanovice na Hané. Lyofilizované sérum bylo rozpuštěno v 1 ml fyziologického roztoku a naředěno v poměru 1:25. Lidská krevní plasma: Pro porovnání aktivity komplementu byla použita plazma lidské krve. Plazma byla získána centrifugací (2000 ot./min., 10 min) kapilární krve po odběru z prstu. Rekombinantní E. coli Použitý bakteriální kmen MC1061 byl získán z Department of Biochemistry and Food Chemistry, University of Turku, Finsko. Jedná se o G– bakterie, které mají do plasmidu inkorporovány tzv. reporter gene lucFF kódující enzym luciferázu (izolován z genomu Photinus pyralis) a její substrát D-luciferin. Takto upravené bakterie vykazují vlastní bioluminiscenci. Obr. 1: Modelové organismy použité v experimentech. Obr. 2: Graf znázorňující růstovou aktivitu bakterií. Late log-fáze nastává přibližně po 3 hod inkubace. METODA: Byla použita metoda podle protokolu k 6th Symposium on fish immunology workshop, vyvinutá na Department of Biochemistry and Food Chemistry, University of Turku, Finsko, 2004. Metoda využívá principy bioluminiscence, kdy světelná emise je výsledkem následující reakce: ATP + D– luciferin + O2→ ADP +PPi + oxyluciferin + H2O Reakce je katalyzována enzymem luciferázou a je závislá na přítomnosti ATP, který je produkován pouze živými buňkami (Lehtinen et al., 2003). Naměřené hodnoty bioluminiscence bakterií jsou úměrné jejich viabilitě. Příprava bakterií: Kultivace bakterií byla provedena v LB-mediu obsahujícím 100µg/ml ampicillinu při teplotě 37°C za intenzivního třepání. Po dosažení late log-fáze (3-4 hod) byly bakterie zcentrifugovány (2000 x g/10min) a 2x promyty PBS pufrem (pH 7,4). Bakteriální suspenze byla upravena na konečnou hustotu OD600= 0,5±0,05, což přibližně odpovídá 2,0 x 108 CFU/ml. Příprava vzorků: Zásobní roztok séra (plasmy) pro klasickou cestu byl připraven jeho naředěním v PBS pufru (pH 7,4) do výsledné koncentrace 400µl/ml. Zásobní roztok séra/plasmy (o výsledné koncentraci 400µl/ml) pro cestu alternativní byl složen z PBS (pH 7,4), 100mM EGTA (pH 7,4). Přítomnost EGTA v reakční směsi je nezbytná pro vychytávání volných Ca2+, které jsou důležité pro aktivaci klasické cesty (Nikoskelainen et al., 2002). DISKUSE A ZÁVĚR: Tato metoda je rutinně používána pro stanovení aktivity komplementu ryb (Nikoskelainen et al., 2002), byla také použita pro lidskou plasmu (Virta et al., 1997). Využití této bioluminiscenční metody i pro další druhy obratlovců by bylo výhodné, neboť se jedná o rychlejší a jednodušší metodu než např. hemolytické stanovení aktivity komplementu pomocí beranních erytrocytů. Každý živočišný druh si ovšem žádá specifické podmínky pro stanovení, mezi nejvýznamnější patří teplota, délka inkubace, příprava vzorků, koncentrace bioluminiscenčních bakterií apod. Z dosavadních výsledků optimalizace metody vyplývá, že pro měření aktivity komplementu každého použitého druhu je potřeba jiný postup. Obecně se zdá, že vyšší aktivitu vykazuje plasma proti séru. Doba inkubace vzorků v příslušné teplotě se pohybuje od 2 do 4 hodin. Pro stanovení je výhodnější použít bakteriální suspenzi s nižší optickou hustotou. Z použitých vzorků má nejúčinější komplementový systém myš, následuje člověk, morče a kapr. Tuto studii chceme do budoucna rozšířit o další živočišné druhy. Z dosavadních výsledků nelze prozatím určit, která z cest aktivace komplementu je účinnější. Literatura: Nikoskelainen S., Lehtinen J., Lilius E-M.: Bacteriolytic activity of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) complement. Develop. & Comparative immunology, 26, 797-804, 2002. Lehtinen J., Virta M., Lilius E-M.:Fluoro-luminometric real-time measurement of bacterial viability and killing. J. of Microbiological Methods, 55, 173-186, 2003. Virta M., Karp M., Ronnemaa S., Lilius E-M.: Kinetic measurement of the membranolytic aktivity of serum complement using bioluminescent bacteria. J. of Immunological Methods, 201, 215-221, 1997.