1 / 53

Molekulární diagnostika treponem a borelií

Molekulární diagnostika treponem a borelií. D. Šmajs. Lymská borelióza. multisystémové onemocnění (kůže, nervový systém, srdce, muskuloskeletální systém) 3 stadia, variabilní příznaky výskyt na severní polokouli ( Evropa, Asie, Severní Amerika )

roberttjohnson
Download Presentation

Molekulární diagnostika treponem a borelií

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Molekulární diagnostika treponem a borelií D. Šmajs

  2. Lymská borelióza • multisystémové onemocnění (kůže, nervový systém, srdce, muskuloskeletální systém) • 3 stadia, variabilní příznaky • výskyt na severní polokouli (Evropa, Asie, Severní Amerika) • nejčastější antropozoonóza v Evropě a Severní Americe • výskyt v ČR: v letech 2000-2009 - 4000 případů ročně • výskyt v USA: v letech 1992-2011 – 439 738 případů • přenáší se klíšťaty Ixodes ricinus complex • poprvé popsána v roce 1975 v městečku • Old Lyme v USA ve státě Connecticut • původce popsán v roce 1982 • Willy Burgdorferem

  3. Původce Lymské borreliózy:Borrelia burgdorferi sensu lato • gramnegativní mikroaerofilní spirochety • známo 20 genospecies (nelze morfologicky odlišit) • pro člověka patogenní • Borrelia burgdorferi sensu stricto (Evropa a Severní Amerika) • Borrelia garinii (Evropa a Asie) • Borrelia afzelii (Evropa a Asie) • Borrelia bavariensis (Evropa a Asie) • Borrelia spielmanii (Evropa) • patogenita dosud neznámá u B. lusitaniae, B. bissettii a B. valaisiana • ostatní druhy pro člověka nepatogenní

  4. Životní cyklus Borrelia burgdorferi sensu lato • přenos klíštětem Ixodes ricinus • přirozený hostitel = malí savci, ptáci, vysoká zvěř • asociace druhu borelie s vektorem • Borrelia afzelii – častěji u hlodavců • Borrelia garinii – u ptactva • Borrelia burgdorferi s.s. – u obou skupin • člověk je konečný hostitel, od něj k dalšímu šíření nedochází Genome sequencing: New tricks of tick-borne pathogen Alan G. Barbour and Wolfram R. Zückert Nature 390, 553-554

  5. Patogeneze onemocnění • borrelie se do těla člověka dostávají během sání krve klíštětem (36-48 hodin po přisátí) • po pomnožení v kůži jsou krví a lymfou transportovány do dalších orgánů (klouby, CNS, srdce) • 3 stadia • Časné lokalizované • Časné diseminované • Pozdní diseminované • po prodělaném onemocnění nevzniká imunita, je možno se znovu nakazit a onemocnět

  6. Stadia onemocnění Časné lokalizované stadium • erythema migrans (může chybět) • nespecifické příznaky: únava, bolest svalů a kloubů, zvýšená teplota, nechutenství Časné diseminované stadium • hematogenní a lymfogenní cestou transport do dalších orgánů • neurologické, revmatologické nebo kardiální poškození

  7. Stadia onemocnění Pozdní diseminované stadium • není známo, zda pozdní projevy onemocnění jsou reakcí na borelie nebo důsledkem zkřížené reaktivity vůči boreliovým antigenům

  8. Genom Borrelia burgdorferi sensu lato • komplexní • referenční kmen B31 (Bbss) lineární chromozom (910 724bp) 12 lineárních plazmidů 9 cirkulárních plazmidů • chromozom a plazmidy lp54 a cp26 – 860 genů = společná genová výbava BBsl • konzervované pořadí genů, stejná struktura operonu pro rRNA 1 kopie 16S rRNA a 2 kopie 5S a 23S rRNA • vysoký podíl genů kódujících lipoproteiny oproti jiným organismům • chybí geny pro syntézu aminokyselin, mastných kyselin, kofaktorů a nukleotidů • chybí geny pro enzymy pro Krebsův cyclus a pro elektronový transport • vlastnosti genomu ukazují na parazitický orgamismus  o velikosti 9-62 kb (celkem 610 694 bp)

  9. Diagnostika Lymské boreliózy Přímá • kultivace • mikroskopie v zástinu • PCR Nepřímá • nepřímá imunofluorescence • ELISA • Westernblot

  10. Přímá diagnostika Lymské boreliózy Kultivace • BSK medium (Barbour-Stoenner-Kelly) • trvá 7-14 dní • nízká citlivost • přímý průkaz aktivní infekce Mikroskopie v zástinu • nízká citlivost • malé množství borelií v klinickém materiálu PCR • důležité: správný odběr vzorku, podmínky transportu a izolace DNA (analýza se musí provést v krátkém čase po odběru nebo vzorky musí být zamraženy) • citlivost závisí na výběru cílového genu a typu klinického materiálu

  11. Molekulární diagnostika Lymské boreliózy Konvenční PCR Nested PCR (vyšší citlivost) Real-time PCR (kvantitativní výsledek) • Optimální délka PCR produktu 100-300 bp • Cílové oblasti v DNA • chromosomální (p66, rRNA geny, rRNA spacery, fla geny, recA) • plazmidové (ospA, ospC)

  12. Molekulární diagnostika Lymské boreliózy – vliv typu klinického materiálu • výběr typu klinického materiálu závisí na symptomech • biopsie kožních lezí (2x2-4x4 mm) EM citlivost 36-88 %, median 69 % ACA citlivost 54-100%, median 76 % • krev, plasma, sérum – citlivost nízká – median 14 % (nízké počty bakterií, možná přítomnost inhibitorů PCR) • mozkomíšní mok (citlivost dle stadia neuroboreliózy a délky případné atb léčby) 12-100 %, median 38 % • synoviální tekutina (u artritidy, citlivost 42-100 %, median 78 %) • výrazně vyšší záchyt u kožních lezí, kde samotná přítomnost léze často stačí k určení diagnózy (a zahájení atb terapie) • záchyt u stadií, kde by se potvrzení/vyloučení diagnózy hodilo je nízký • význam molekulárního záchytu spočívá spíše v možnosti určení druhu původce a molekulárního typování pro predikci vývoje onemocnění a epidemiologické účely

  13. Nepřímá diagnostika Lymské boreliózy Serodiagnostika – detekce protilátek proti antigenům patogena v séru pacienta nepřímá imunofluorescence • nevýhoda - potřeba fluorescenční mikroskopie a školeného personálu ELISA • detekce specifických protilátek třídy IgM a IgG (většinou společně) • jako antigen lze použít sonikát kultury Borrelia burgdorferii, případně samostatný antigen nebo kombinace • vhodné sety pro endemické genospecies (různé druhy borelií mají různé sekvenční varianty téhož antigenu) • vysoká falešná negativita, zejména v časných fázích infekce (méně než týden po objevení EM) • falešná pozitivita způsobená reaktivitou s lidskými antigeny, proto se doporučuje dvoustupňové vyšetření ELISA + Westernblot Westernblot • vysoká citlivost • detekce protilátek třídy IgM a IgG odděleně • volba vhodných antigenů je důležitá • vhodné sety pro antigeny, které se exprimují při infekci savčího hostitele

  14. Nepřímá diagnostika Lymské boreliózy Antigeny pro časné stadium nemoci • FlaB flagelární protein flagelin (41 kDa) – některé epitopy reagují také s antigeny nervové tkáně, synovia a srdečního svalu a také s jinými bakteriálními antigeny • FlaA flagelární protein (37 kDa) • OspC (21-25 kDa), kódován na plazmidu, silně imunogenní, různé sekvenční varianty mezi různými druhy i v rámci jednoho druhu, pro detekci se používá epitop u C-konce, který je konzervován • BmpA (39 kDa) – existují různé sekvenční varianty mezi různými druhy • DbpA (17 kDa) – existují různé sekvenční varianty mezi různými druhy Antigeny pro pozdní stadia onemocnění • OspA (31 kDa) – kódován na plazmidu, různé sekvenční varianty • OspB (34 kDa) – kódován na plazmidu, různé sekvenční varianty • VlsE (34-35 kDa) – kódován na plazmidu, variabilní, ale existuje region IR6, který je konzervován a je slibným kandidátem pro široce použitelnou detekci Limitace u většiny antigenů –nelze použít univerzálně pro detekci borelií, protože se sekvenčně liší u různých druhů

  15. Detekce DNA v klinických vzorcích • klinický materiál: plná krev, mozkomíšní mok, synoviální tekutina • izolace DNA na přístroji Qiacube (Qiagen) • plně automatizovaná izolace pomocí kolonek • 2-12 vzorků (sudý počet) • 200 mikrolitrů klinického vzorku => 100 mikrolitrů eluátu

  16. Amplifikace lokusu 5S-23S rRNA spacer oblast genomu nesoucí geny pro rRNA 1 kopie 16S rRNA a 2 kopie 5S a 23S rRNA primer P2 primer 23SC1 Nested PCR (dvoukroková PCR) Produkt 1. kroku nested PCR (391 bp) primer 23SN1 primer P1 Produkt 2. kroku nested PCR (242 bp)

  17. Amplifikace lokusu 5S-23S rRNA spacer- příklad vyšetření z plné krve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 + - Vyšetření pro 1 mikrolitr eluátu do reakce 1. kroku Vzorek 6 pozitivní => sekvenování PCR produktu 100 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 + - Vyšetření pro 10 mikrolitrů eluátu do reakce 1. kroku Vzorek 6 – možná přítomnost inhibitorů PCR V pozitivní kontrole patrný také produkt prvního kroku (391 bp) 100 bp 1,5 % agarózový gel 90V, 60 minut barvení EtBr

  18. Detekce DNA v klinických vzorcích • amplifikace oblasti mezi 5S a 23S rRNA • nested PCR • sekvenování produktu => porovnání se sekvencemi v databázi (BLAST) => zařazení do druhu, případně detekce sekvenčních změn v porovnání se známými sekvencemi • tento vzorek: Borrelia garinii • detegovány 3 SNP proti kontrolnímu izolátu Borrelia garinii z klíštěte

  19. Detekce DNA v klinických vzorcích- výsledky • vyšetřeno 145 vzorků plné krve a 90 vzorků likvoru (od 121 pacientů) • pozitivní 9/145, 4/90 • jedná se o kmeny B. burgdorferii sensu stricto (12) B. afzelii (1) nepodařilo se sekvenovat (2) • u 2 vzorků BBss byla detekována sekvenční změna oproti kontrole = sekvenčně unikátní vzorek

  20. Genus Treponema ~28 species T. amylovorum T. azotonutricium T. berlinense T. brennaborense T. bryantii T. calligyrum T. carateum T. denticola T. isoptericolens T. lecithinolyticum T. maltophilum T. medium T. minutum T. pallidum T. paraluiscuniculi T. parvum T. pectinovorum T. pedis T. phagedenis T. porcinum T. primitia T. putidum T. refringens T. saccharophilum T. socranskii T. succinifaciens T. vincentii T. zioleckii UNCULTIVABLE PATHOGENIC TREPONEMES http://cs.wikipedia.org/wiki/Treponema_pallidum OBLIGATE PATHOGENS of HUMANS and ANIMALS: BOVINE DIGITAL DERMATITIS • T. brennaborense • T. pedis subsp.pallidum • T. pallidum subsp.pertenue subsp.endemicum PERIODONTAL INFECTIONS • T. carateum • T. denticola • T. vincentii • T. paraluiscuniculi

  21. Pathogenic treponemes in humans ? extinct ENDEMIC TREPONEMATOSES Characteristics of T.pallidum subspecies • DIFFERENCES • invasiveness and pathogenicity • clinical manifestation • mode of transmission • congenital infection • age distribution • geographical distribution • SIMILARITIES • obligatehumanpathogens • uncultivable • serologically and morphologicallyindistinguishable • small genome size (~1.14 Mbp) • T. pallidum subspecies >99.8%identical at DNA level • geneticallymonomorphicbacterialpathogens

  22. Pathogenic treponemes in animals T. PALLIDUM subsp. PERTENUE natural treponematosis of the African primates strain Fribourg-Blanc • Papio • Colobus • Erythrocebus • Chlorocebus • Cercocebus • Macaca • Gorilla • Pan Oryctolagus cuniculus Lepus europaeus Lepus timidus Papio cynocephalus (yellow baboon) pathogenic for humans non-pathogenic for humans unknown pathogenicity for humans

  23. Treponema pallidumsubspecies ENDEMIC SYPHILIS YAWS SYPHILIS ENDEMIC TREPONEMATOSES

  24. Syphilisstages Relapse of symptoms Asymptomatic LATENT STAGE early late <1 year 1 - 30 years 10 – 90 days 4 weeks – 6 months Early syphilis Late syphilis SECONDARY STAGE PRIMARY STAGE TERTIARY STAGE Genital lesion Skin rash, enlarged lymph nodes, fever, sore throat, malaise, headache Gummatous syphilis Neurosyphilis Cardiovascular syphilis 1 – 6 weeks 3 – 6 weeks

  25. Incidence ofsyphilis Number of cases Incidence ofsyphilis in the Czech Republic

  26. Distribution of yaws, 2012

  27. Whole genome sequencing: 12 type strains have been sequenced and analyzed … SYPHILIS-causing strains 1998 Nichols 1912 Washington, D.C. 2008 SS14 1977 Atlanta, GA 2010 Chicago 1951 Chicago, IL 2012 DAL-1 1991 Dallas, TX 2012 Mexico A 1953 Mexico 2014 Sea81-4 1981 Seattle, WA YAWS-causing strains 2012 Samoa D 1953 Samoa 2012 Gauthier 1960 Nigeria 2012 CDC-2 1980 Nigeria NOW BEING SEQUENCED/ANALYZED … BEJEL-causing strains 2014 Bosnia A 1953 Bosnia simian isolate M5-40 2007 Tanzania unspecified simian isolate (Papio cynocephalus) YAWS-causing strains 2013 Fribourg-Blanc 1966 Guinea CDC-2575 1980 Ghana Ghana-051 1988 Ghana Kampung Dalan 1990 Indonesia Sei Geringging 1990 Indonesia T. paraluiscuniculi - rabbit syphilis 2011 Cuniculi A ? ? SYPHILIS-causing strains Philadelphia-1 1988 Philadelphia, PA Grady-1 1998 Atlanta, GA Madras 1954 India Bal 73-1 1973 Baltimore, MD

  28. Preliminary data: 19 clinical samples sequencedat >95% >5 coverage T.p. endemicum ENDEMIC SYPHILIS (BEJEL) T.p. pallidum SYPHILIS SS14-like • 1 nt substitution / genome / year • ~400 SNPs: Nichols-like vs. SS14-like strains Nichols-like T.p. pertenue YAWS Iraq B

  29. Comparative genomics TPA 99.93 – 100 % TPE 99.96 – 99.98 % TPA / TPE 99.80 – 99.84 % TPA / TEN 99.79 – 99.82 % TPE / TEN 99.91 – 99.94 % TPA vs. TPE, TEN = ~2000 SNPs

  30. Whole genome alignments T. pallidum subsp. endemicum ENDEMIC SYPHILIS (BEJEL) T. pallidum subsp.pallidum SYPHILIS SS14-like T. pallidum subsp. Pertenue YAWS Nichols-like

  31. Strains pathogenic for animals (baboon, guenon and mangabey) in Africa are closely similar to yaws-causing strains westAfrica no symptoms yaws eastAfrica anogenital lesions syfilis S. Knauf, unpublished data

  32. Genomics revealed genes involved in pathogenesis: genome comparisons of non-pathogenic, pathogenic and mild invasive treponemes Invasiveness to tissue The ability to infect human hosts TPE TP ec. Cuniculus mcp1(0040) capD(0077) ushA(0104) anti-sigma factor antagonist (0220) ABC superfamily ATP transporter(0309) ssb(0310) tprE(0313) tprG (0317) transcriptional regulators(0461, 0511) sensor histidine kinase (0520) mglB (0545) gltD (0735) pbp(0760) clpA(0801) fadD(0812) recB(0898) hlyC(0936) recX (1023) DNA replication, repair, recombination tprA (0009) recQ (0103) tprC (0117) tprD (0131) fibronectin binding protein (0136) tprF (0316) tp92 (0326) arp (0433) mcp2-1(0488) tprI(0620) tprJ (0621) tprK (0897) tprL (1031) RecQ Antigens Mcp ethanolamine-phospho-transferase (0671) Potential virulence factors Tpr proteins Cell envelope components Šmajs et al. 2011, PLoS One Čejková et al. 2012, PLoS Negl Trop Dis

  33. Most diverse/variable loci TP0133 TP0134 TP0462 TP0733 tprA (TP0009) tprB (TP0011) TP0136 tprC (TP0117) TP0856 TP0858 TP0859 TP0865 TP0548 tprD (TP0131) TP0488 tprE (TP0313) TP0040 TP0639 TP0640 TP0326 tprF (TP0316) REPETITIONs: tprG (TP0317) arp (TP0433) tprH (TP0610) Genetic diversity is in syphilitic strains accumulated in a few genomic regions TP0470 tprI (TP0620) tprJ (TP0621) tprK (TP0897) MOLECULAR TYPING of CLINICAL ISOLATES tprL (TP1031) • CDC typing system (enhanced) arp; tprE, G, J (TP0548) • Sequence-based typing system TP0136, TP0548, 23S rDNA other loci TP0314, TP0617, TP0618, TP0619 … (tpr – Treponema pallidumrepeat gene) (arp – acidic repeat protein gene)

  34. clinical manifestation medical history microscopy serology Diagnostics DIAGNOSIS RPR serological test TPHA serological test

  35. Moleculardiagnosticsofsyphilis Diagnostic loci T. pallidum genome 1 500 100 200 300 400 600 700 800 900 1000 1138 kbp TP0319 (tmpC) 16S rRNA TP0117 (tprC) TP0105 (polA) TP0574 (tpp47) TP1016 (bmp) TP1038 (tpF1) TP0768 (tmpA) TP0769 (tmpB) Diagnostic loci Gene Gene function Reference TP0105 DNA polymeraseI Liu et al., 2006 TP0117 Tprprotein C Rajan et al., 2006 TP0319 membrane lipoprotein Flasarová et al., 2006 TP0574 carboxypeptidaseBurstain et al., 1991 TP0768 antigen Hay et al., 1990 TP0769 antigen Hay et al., 1990 TP1016 membraneprotein Noordhoek et al., 1991 TP1038 antigen Hay et al., 1990 16S rRNA Centurion-Lara et al., 1997

  36. Moleculardiagnostics – typesof PCR - lower sensitivity PCR Multiplex PCR Nested-PCR Real-time PCR + detectionofcausativeagentsofgenitalulcers in onereaction (T. pallidum, Haemophilusducrei, Herpes simplex virus) + quantitative results + fast method + low risk ofcontamination + high sensitivity • contamination • time-consuming • hard to use for molecular typing purposes - results dependent on sample type and syphilis stage - lower sensitivity

  37. Moleculartypingofsyphilistreponemes T. pallidum genome TP0136 23SrRNA TP0548 500 1 100 200 300 400 600 700 800 900 1000 1138 kbp tprE, tprG arp tprJ • TP0136/TP0548/23S rRNAtyping • sequencing-basedtypingscheme • detectionofmacrolideresistance • Flasarová et al., 2006 • CDC typing (arp/tprEGJgenes) • arpgene: numberof tandem repeats (60 bp) • tprEGJgenes: MseIrestriction digest • Pillay et al., 1998 • Enhanced CDC typingsystem (arp/tprEGJgenes/TP0548) • arpgene: numberof tandem repeats (60 bp) • tprEGJgenes: MseIrestriction digest • sequencingof 86 bpof TP0548 • Marra et al., 2010

  38. Sequencing-based typing system T. pallidum genome 23S rRNA TP0548 TP0136 4 sequence types A2058G A2059G 11 sequence types

  39. Sequencing-based typing system T. pallidum genome 23S rRNA TP0548 TP0136 4 sequence types 11 sequence types Enhanced CDC-typing Marra et al., 2010

  40. PCR diagnostics and moleculartyping in the Czech Republic TP0136 23SrRNA TP0548 T. pallidum genome TP0105 (polA) TP0319 (tmpC) 500 1 100 200 300 400 600 700 800 900 1000 1138 kbp PCR diagnostics TP0105 (Liu et al., 2006) TP0319 (Flasarová et al., 2006) NESTED PCR • TP0136/TP0548/23S rRNAtypingsystem • Sequencing-basedtypingscheme • Detectionofmacrolideresistance • Flasarová et al., 2006 1st step of nested PCR 2nd step of nested PCR

  41. MboII • BsaI • BsaXI Wild type A2058G A2059G Detectionofmacrolideresistance (A2058G or A2059G) Sequencing 2059 2058 RFLP analysis

  42. PCR diagnostics in the Czech Republic TP0136 23S rRNA TP0548 TP0105 (polA) TP0319 (tmpC) T. pallidum genome 500 1 100 200 300 400 600 700 800 900 1000 1138 kbp PCR DIAGNOSTICS: amplification of 5 treponemal loci using 1/10 µl DNA, PCR positive sample than means detection of at least oneloci SEROLOGY combination of at least one treponemal and one non-treponemal tests PCR DIAGNOSTICS Success rate if treponemal DNA detection: 51 %

  43. Factorsaffecting PCR detectionoftreponemal DNA – impactofthelengthof PCR product Successrateofamplification Optimizationofamplification Number of samples polA tmpC 23S rRNA TP0548 TP0136 Optimization of PCR conditions led to higher relative frequency of PCR positive samples (p=0,0003) Shorter genes are amplified with higher success rate

  44. Factors affecting PCR detection of treponemal DNA – impact of clinical material type PCR positive Number of samples tested 66 % 60 % 36 % 10 % 2 % swab whole blood serum tissue CSF

  45. Molecular typing of syphilis-causing strains in the Czech Republic using sequencing-based typing • 16 differentgenotypes • Most genotypesshowedgeneticrelatedness to TPA SS14 strain, onlyone genotype wassimilar to TPA Nichols • Dynamicspectraof TPA strains in population Relative frequency of genotypes according to the color code.

  46. T. pallidum subsp. pallidum clinical isolates: predominance of SS14-like strains 970 worldwide clinical isolates chacarterized by sequencing of short gene fragment of TP0548. SS14-like : Nichols-like 907 : 63 94% ofworldwide TPA clinicalisolatesbelong to SS14-like strainsalthough most reference strainsbelong to Nichols-likestrains Nichols-like strains SS14-like strains

  47. History of the use of macrolide antibiotics in syphilis treatment 2000 2009 1950 1977 1993 2002 2011 2015 ERYTHROMYCIN AZITHROMYCIN ? erythromycin treatment failure erythromycin for treatment of primary, secondary and latent stage of syphilis A2058G A2059G azithromycin not recommended in MSM patients – risk group erythromycin not suitable for treatment of pregnant woman erythromycin replaced by azithromycin Mechanism of macrolide resistance Resistance mechanism in T. pallidum Mutation of the target site (the peptidyl transferase region in domain V of 23S rRNA)

  48. Macrolidetreatmentfailures • First published macrolide treatment failure 1983 • Stapleton et al., 1985 • Stamm et al., 1988 • Ducan, 1989 • Sands and Marcus, 1995 • Klausner et al., 2006 • Lukehart et al., 2004 • Mitchell et al., 2006 • Matějková et al., 2009 • Zhou et al., 2010 • Woznicová et al., 2010

  49. Increasing rate of macrolide resistant strains in the Czech Republic (2004-2014) Relative prevalence of macrolide-resistant TPA isolates • Macrolide resistance-causing mutation A2058G was identified in 2000. In the Czech Republic, the A2058G mutation was firstly detected in 2006. Second mutation causing macrolide resistence in T. pallidum A2059G was firstly identified and described in the Czech Republic in 2007. • Mutations A2058G or A2059G were always detected in both copies of 23S rRNA. • The number of macrolide-resistant isolates increased over time. • In 2014, the number of macrolide resistant strains in the Czech Republic reached 82%.

  50. Relative prevalence of A2058G a A2059G mutations during 2007-2013 Number of used macrolides antibiotics Relative prevalence of mutations • Mutation A2058G causes resistence to azithromycin, clarithromycin, erythromycin and roxithromycin • Mutation A2059G causes resistence to macrolides including spiramycin

More Related