实验一植物的组织培养 实验原理

1. 实验一植物的组织培养 实验原理 植物组织培养是指植物的任何器官、 组织或细胞，在人工预知的控制条件下，放在含有营养物质和植物生长调节物质等组成的培养基中，使其生长、分化并形成完整植株的过程。其理论依据是植物细胞具有全能性。

2. 组织培养的特点是：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。组织培养不但是进行细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科研究的重要手段；而且在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。组织培养的特点是：取材少，培养材料经济；人为控制培养条件，不受自然条件影响；生长周期短，繁殖率高；管理方便，利于自动化控制。组织培养不但是进行细胞学、遗传学、育种学、生物化学和药物学等学科研究的重要手段；而且在农学、园艺、林业和次生代谢产物工程等生产领域得到广泛的应用。

3. 培养基是植物组织培养中的主要部分，除了培养材料本身因素外，培养基的种类和成分等直接影响培养材料的生长和发育，应根据培养材料的种类和培养部位选择适宜的培养基。培养基的种类很多，不同的培养基有其不同的特点。培养基是植物组织培养中的主要部分，除了培养材料本身因素外，培养基的种类和成分等直接影响培养材料的生长和发育，应根据培养材料的种类和培养部位选择适宜的培养基。培养基的种类很多，不同的培养基有其不同的特点。

4. 培养基的主要成分： 水 无机成分： 无机大量元素 氮： 铵态氮、硝态氮混合 磷： 磷酸盐 钾： 钾盐 钙、硫、镁 无机微量元素 主要有：铁、硼、锰、锌、铜、钼、钴、氯 有机成分： 糖、 维生素、肌醇、氨基酸及有机附加物。 植物生长调节物质： 生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D 细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT 其他类： GA3, ABA， PP333 琼脂 pH值

5. 配制培养基最方便的方法是预先配制不同组分的培养基母液，贮藏在冰箱，待配制培养基时取出，按比例稀释。配制培养基最方便的方法是预先配制不同组分的培养基母液，贮藏在冰箱，待配制培养基时取出，按比例稀释。 配制母液时为了减少工作量可以把几种药品配在同一母液中，但是应该注意各种化合物的组合以及加入的前后顺序，应该把钙离子、锰离子、钡离子和硫酸根和磷酸根例子错开，以免发生沉淀。 把每种试剂单独溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应该注意加样顺序。

6. 铁盐单独配制，其配法为5.57g 的硫酸亚铁（Fe SO4.7H2O）和7.45g乙二胺四乙酸二钠（Na2-EDTA）溶于1L水中，用时每配1L培养基，取该溶液5ml。 IAA 、IBA、NAA等可用少量的乙醇溶解，然后在加水定容。2,4-D可用1 N的Na OH 溶解然后再定容； KT和6-BA应先定容于少量的1 mol/L 的HCl中，再加水定容。玉米素应该溶于95% 的乙醇中再定容。 pH值对培养基的凝固情况和植物材料的生长有很大的影响，因此，等培养基配好后，应该立即调整培养基的pH ,最好用酸度计，既快又准。培养基配好后应该立即分装，体积一般为容器的 1/4 或者1/3为好。

7. 器材和药品 高压蒸汽灭菌锅、洁净工作台、循环水式真空泵、电子天平、酸度测定仪、光照培养箱,搪瓷杯、搪瓷盘、100 ml三角烧瓶（12个/组）、250 ml三角瓶（2个/组）、试剂瓶、解剖刀柄与刀片、单面刀片、剪刀、长镊子、培养皿、移液管、漏斗、量筒、烧杯（50、100、500、1000 m1），酒精灯、火柴、玻璃棒、吸耳球、封口薄膜、牛皮纸、线绳、牛皮筋、脱脂棉、滤纸、pH试纸（5.4-7.0）、标签纸、称量纸、药勺等。

8. 次氯酸钠消毒液, 75%的酒精 ,0.2％的升汞溶液. • 1 N 盐酸,1 N NaOH,0.8%的琼脂,3%的蔗糖. 0.1 mg/ml的2,4-D溶液：取25 mg的 2,4-D，加入少量95%的酒精和1 N的NaOH溶解，再加蒸馏水定容至250 ml。 • 0.1 mg/ml 的6-BA溶液：取25 mg的6-BA，用少量1 N的盐酸溶解，再加蒸馏水定容至250 ml。

9. 表.1 MS培养基储备液的配制

10. 实实验步骤 P培养基的配制 11．母液配制：按照表 1分别配制，并在4 ℃冰箱中保存。 22.植物激素配制：称取10 mg NAA,加入少量酒精，并加水定容50 ml (浓度为0.2 mg/ml), 用同样的方法配制2，4-D母液。 称取 50 mg 6-BA, 加少量的1 mol/L HCl，使其充分溶解，然后加水至50 ml (浓度为1 mg/ml) 。 4

11. 3．MS基本培养基的配制：分别吸取MS贮备液30.0 ml（大量元素）、3.0 ml微量元素、 3.0 ml铁盐、 3.0 ml有机, 加入1 L的搪瓷缸中，然后称取蔗糖18.0g, 加入琼脂4.8g，加蒸馏水约550 ml，在电炉上加热，煮沸，融化琼脂，然后加水至560ml。 4. 不同激素浓度培养基的配制：取200ml烧杯3个，分别吸取所需要的2,4-D溶液(0.5mg/L, 1mg/L, 2mg/L 所需要的体积为：1.0，2.0, 4.0ml)，然后加入MS基本培养190ml，搅拌均匀后，用10%的NaOH调节pH至5.8。  加水定容至200ml。 5. 将配制好的培养基分装于50ml三角瓶中，盖上封口膜，并用牛皮纸包扎。

12. 操培养基灭菌 11.打开灭菌锅盖，向锅内加水。 22.加水后，将待灭菌的物品放入锅内，不要放的太多，以免影响灭菌效果。物品不要近靠锅壁，以免冷凝水顺壁流入物品中。 33.加盖旋紧螺旋。 44.打开放汽阀，加热，自开始产生蒸汽后5分钟，再关紧放汽阀，此时锅内的冷空气已由排气孔排尽，让温度随蒸汽压力的增高而上升。 5

13. 5. 待压力逐渐上升到所需压力时（一般为15磅/时， 1.034×10 5Pa）, 灭菌20分钟。 6． 灭菌后，待压力降至0时，开盖，取出灭菌物品。（在压力未完全下降前，切勿打开锅盖）。

14. 胡萝卜组织培养 1. 取两个50ml的小烧杯,分别倒入25ml的70%的酒精和0.2%的升汞。 2. 取胡萝卜贮藏根，洗净，然后将胡萝卜根于70％酒精中浸泡数秒钟。 3. 浸于0.2％氯化汞（升汞）液中消毒灭菌10 min后,再用无菌水冲洗3—4次。 4. 将灭菌材料放在灭菌的滤纸上,吸干水分。 5. 用解剖刀将胡萝卜切去表皮和中柱，取皮层，切成0.5cm见方的小块，接种于MS附加 2.0mg/L 2，4-D 培养基内,于 25℃，黑暗或漫射光下培养,14—21 天后继代一次。

15. 水稻成熟胚组织培养 1. 取成熟种子，用 70％乙醇浸l min，转至l.5％次氯酸钠溶液（ 含有0.01%吐温20）浸泡l.5—2 h后，用无菌水冲洗4～5次，置无菌滤纸上吸干多余水分。 2. 将成熟胚置于含 2 mg／L 2，4－D的 MS固体培养基上，27 ℃暗培养诱导愈伤组织 10天后（成熟胚）继代一次。

16. 注意事项： • 配制培养基时，一定要注意调节pH。 2.外植体不能太小，否则会影响愈伤组织的形成。

17. 结果 外植体经过20天的培养后，长出淡黄色的愈伤组织。

18. 思考题 1，植物组织培养的理论基础是什么？ 2，培养基的成分主要有那几类？