Oksidativ fosforylering

1. Oksidativ fosforylering ATP syntese Winnie Eskild. IMBV 2004

2. Oksidativ fosforylering er siste trinn i nedbrytning av energigivende forbindelser • Elektroner fra • Glykolyse • Beta-oksidasjon • Sitronsyre syklus • Elektronene bæres av NADH eller FADH2 • Elektronene avslutter sin vandring gjennom elektrontransportkjeden med å redusere oksygen

3. Oksidativ fosforylering • Oksidativ fosforylering finner sted i mitokondriene • De involverte proteiner er integrerte i indre mitokondriemembran eller tett assosiert til den • Her reduseres O2 til H2O og ATP dannes fra ADP og Pi

4. Oksidativ fosforylering • Oksidativ fosforylering kan deles i to deler: • Transport av elektroner gjennom elektron transportkjeden og reduksjon av oksygen som binder protoner og blir til vann. Dette frigir energi som brukes til å pumpe protoner ut gjennom den indre membranen i mitokondriet. • Tilbakeføring av protoner til matriks langs deres elektrokjemiske gradient og utnyttelse av den frigjorte energien til fosforylering av ADP til ATP.

5. Mitokondriet • Mitokondriet er omgitt av to membraner • Ytre membran er fritt permeabel for små molekyler og ioner (< 5000 Da) via porin • Indre membran har mye større areal enn ytre, foldet i ”kristae” • To funksjonelle rom: indre(matriks) og ytre • Indre membran er ikke permeabel for andre forbindelser enn de som har egne transportører • Proteinene som utfører oksidativ fosforylering sitter i indre membran • Elektrontransportkjeden • ATP syntasen

6. Mitokondriematriks • Her foregår SSS, fettsyre- og aminosyre nedbrytning, prosesser som frigir mange elektroner • Disse elektronene bæres av kofaktorene: NAD+ (NADP+), FAD og FMN • NAD+ kan bære to elektroner • FAD og FMN kan bære en eller to elektroner • Flavonukleotidene er sterkt bundet til de enzymer som de er kofaktorer for og som kalles flavoproteiner • Noen flavoproteiner overfører sine elektroner direkte til elektrontransport kjeden, f.eks succinat dehydrogenase (SSS) • De fleste av elektronene fra flavonukleotidene overføres til NAD+ • NAD+/NADH kan fritt bevege seg omkring og levere elektronene sine til elektrontransport kjeden fra matrikssiden

7. Overføring av NADH til mitokondriematriks • Ikke alle NADH dannende prosesser finner sted i mitokondriematriks • NADH fra glykolysen er dannet i cytosol og må overføres til matriks før det kan levere elektronene videre til elektrontransport kjeden • Indre mitokondriemembran er ikke permeabel for NADH

8. Overføring av NADH til mitokondriematriks • To veier inn i elektrontransport kjeden: • Elektronene fra NADH i cytosol overføres i molekylet malat via malat-aspartat shuttle. I matriks gjendannes NADH • Glyserol-3-fosfat dehydrogenase

9. Malat-aspartat shuttle

10. Malat-aspartat shuttle 1)Enzymet malat dehydrogenase bruker NADH sine elektroner til å redusere oksaloacetat til malat 2) Malat transporteres gjennom membranen i bytte for a-ketoglutarat Transportøren er malat- a-ketoglutarat-transportøren, en antiporter

11. Malat-aspartat shuttle 3) I matriks reoksideres malat til oksalo-acetat av enzymet malat dehydro-genase (egne mitokondrie isoenzymer). Elektronene overføres til NAD+ som blir til NADH Denne NADH vil levere elektronene videre til elektrontransport kjeden Oksaloacetat må gjendannes i cytosol ellers stopper transporten opp 4)Oksaloacetat omdannes til aminosyren aspartat i en transamineringsreaksjon hvor glutamat leverer aminogruppen Enzymet her er aspartat aminotrans-ferase

12. Malat-aspartat shuttle Herved omdannes glutamat selv til a-ketoglutarat 5) Aspartat overføres til cytosol via glutamat-aspartat transportøren i bytte for glutamat som hentes inn i mitokondriematriksen a-ketoglutarat overføres til cytosol via malat- a-ketoglutarat transportøren, en antiporter

13. Malat-aspartat shuttle 6) Aspartat, nå i cytosol, avgir aminogruppen til a-ketoglutarat Enzymet er aspartat amino-transferase Resultatet er gjendannelse av oksaloacetat og glutamat Netto resultat: overføring av to elektroner og en proton til mitokondriematriks, bundet til NADH og klar til videreførsel til elektrontransport kjeden

14. Glyserol-3-fosfat dehydrogenase (cyt) Finnes spesielt i skjelett-muskel og hjerne Cytosol NADH donerer elektronene til reduksjonen av dihydroksyacetone-fosfat Enzymet er glyserol-3-fosfat dehydrogenase (cyt.) og det blir dannet glyserol-3-fosfat

15. Glyserol-3-fosfat dehydrogenase (mito) Glyserol-3-fosfat reoksideres til dihydroksyacetonefosfat av enzymet glyserol-3-fosfat dehydrogenase (mito) som sitter i mitokondrie-membranen Dette enzymet overfører elektronene til FAD FADH2 gir elektronene videre til elektrontransport kjeden

16. Elektrontransport • Fire typer elektrontransport 1) Direkte overføring: Fe 3+ + e- => Fe 2+ 2) H-atom overføring, dvs. H+ + e- : FAD +e- + H+ => FADH 3) Hydridion overføring, dvs. H+ + 2e- : NAD+ +2H+ + 2e- => NADH + H+ 4) Direkte overføring av e- til O2 : 4e- + O2 + 4H+ => 2 H2O Alle fire typer finnes i elektrontransportkjeden Begrepet reduserende ekvivalent brukes om én elektron som overføres

17. Elektrontransportkjedens elektronbærere Ubiquinon • Fettløselig benzoquinon med lang isoprenhale • Diffunderer fritt i membranen • Aktiv i membranassosierte elektronoverføringer • Tar imot og gir fra seg en elektron og en proton om gangen • Tar imot høyst to elektroner • UQ + e- + H+ <=> UQH. + e- + H+ <=> UQH2

18. Elektrontransportkjedens elektronbærere Cytokromene • Stor gruppe, deles i a, b, c • Har jern-porfyrin prostetisk gruppe • A og b-gruppen har tett men ikke kovalent bundet jern-porfyringruppe • C-gruppen har kovalent bundet jern-porfyringruppe • Absorberer lys => er fargete (brune) • Gis ofte navn etter bølgelengden med maksimal absorbsjon: cyt b562 • Har jern-svovl senter som også deltar i elektronoverføring • De fleste cytokromer er integrerte membranproteiner, viktig unntak er cytokrom c

19. Cytokromenes prostetiske grupper Kovalent bundet til Cys

20. Cytokromene absorberer lys • Cytokrom c er vannløselig • Assosierer ved hjelp av ladning med utsiden av mitokondrienes indre membran

21. Cytokromene har også Fe-S senter • Enkle jern-svovl proteiner: Uorganisk Fe er bundet direkte til Cys • Komplekse jern-svovl proteiner: Uorganisk Fe og S bundet til Cys eller His • Fe-S senteret overfører én elektron om gangen • Reduksjonspotentialet modifiseres av proteinet: - 0,65 + 0,45V • Disse proteinene absorberer lys i synlig område

22. Elektrontransportkjeden - oversikt 4H+ Bare kompleks I bidrar til protonoverføring Elektroner kommer inn fra 4 retninger og samles i ubiquinol: 1) NADH dehydrogenase (I) 2) Succinat dehydrogenase (II) 3) Glyserol-3-fosfat dehydrogenase 4) Elektronoverførende flavoprotein Kompleks II er succinat dehydrogenase fra sitronsyresyklus III = Ubiquinon-cytokrom c oksidoreduktase IV = Cytokrom oksidase

23. Elektrontransportkjeden 4H+ Elektroner kommer inn fra 4 retninger og samles i ubiquinol: 1) NADH dehydrogenase (I) 2) Succinat dehydrogenase (II) 3) Glyserol-3-fosfat dehydrogenase 4) Elektronoverførende flavoprotein Bare kompleks I bidrar til protonoverføring Kompleks II er succinat dehydrogenase fra sitronsyresyklus

24. Elektrontransportkjeden Elektroner fra ubiquinol: III = Ubiquinon-cytokrom c oksidoreduktase IV = Cytokrom oksidase

25. Elektronenes vandringsretning • Elektronene vandrer mot høyere standard reduksjonspotentialene • NADH-> Q -> cyt b -> cyt c1 -> cyt c -> cyt a -> cyt a3 -> O2 • Hemmerne rotenon, antimycin A, CN- og CO blokkerer ETK på spesifikke punkter

26. Nettoreaksjon fra NADH/FADH2 til O2 • NADH + H+ + 1/2 O2 H2O + NAD+ • DG’o = - 220 kJ/mol, DG er nummerisk større i cellen • FADH2 + 1/2 O2 H2O + FAD • DG’o = - 150 kJ/mol • Sterkt eksergone reaksjoner • Energien brukes til å pumpe protoner ut av matriks • Overføring av to elektroner fra NADH til O2 medfører utpumping av 10 protoner => dannelse av 2,5 ATP • Overføring av to elektroner fra FADH2 til O2 medfører utpumping av 6 protoner => dannelse av 1,5 ATP

27. Kjemiosmotisk modell • H+ ute = 10X H+ inne • Elektronenes vandring gjennom elektrontransportkjeden har medført: • Frigjøring av energi ved overføring av elektroner til O2 • Transport av protoner ut av matriks • Ennå mangler syntesen av ATP

28. Kjemiosmotisk modell • Ifølge denne modellen ligger den elektrokjemiske energien i proton-gradienten og ladningsforskjellen over mitokondriemembranen • ATP syntesen drives av denne proton drivkraften • Disse er koplete slik at ATP syntesen er avhengig av proton drivkraften og proton drivkraften (protongradient + ladningsforskjell) er avhengig av ATP syntesen

29. Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese • Hemming av ATP syntese blokkerer elektronoverføring • Har man isolerte mitokondrier og tilsetter succinat (elektron-donor) ses lite O2 forbruk • Tilsettes ADP + Pi starter elektron-overføringen som avleses som O2 forbruk • Nødvendigheten av ATP syntese ses ved stans i O2 forbruket når ATP syntase hemmes av venturicidin eller oligomycin • Dinitrofenyl (DNP) kopler elektron-overføringen fra ATP syntese

30. Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese • Blokkering av elektronoverføring hemmer ATP syntese • Har man isolerte mitokondrier og tilsetter ADP og Pi ses lite O2 forbruk og lite ATP syntese • Tilsettes succinat starter elektronoverføringen som avleses som O2 forbruk • Nødvendigheten av elektron-overføring for ATP syntese ses ved stans i ATP syntese når CN- tilsettes • Cyanid hemmer e- -overføring mellom III og IV

31. Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese • Hvorfor stopper elektronoverføringen når ATP syntesen hemmes ? • Hemmet ATP syntese betyr her at ATP syntasens protonkanal er lukket • Protonutpumpningen fra mitokondriematriks kan fortsette en liten stund, men protongradienten blit steilere og steilere • Til sist er forskjellen i protonkonsentrasjon mellom mitokondrienes indre og ytre rom for stor • Den energi som frigjøres ved elektronoverføring er ikke lenger tilstrekkelig til å pumpe ut protoner mot en konsentrasjonsgradient

32. Kopling av elektronoverføring og ATP-syntese • DG er avhengig av DpH og DY som blir for store når ingen protoner får slippe inn i matriks igjen

33. Avkoplere • En del kjemiske forbindelser er istand til å kople elektronoverføring fra ATP syntesen uten å ødelegge mitokondriemembranen • Hydrofobe, svake syrer er udissosierte i cytosol. • De passerer mitokondriets indre membran og dissosierer i matriks som er mere alkalisk enn cytosol • Herved øker protonkonsentrasjonen i matriks og ødelegger protongradienten • Elektronoverføringen fortsetter men det dannes ingen ATP • Eksempler: dinitrofenyl (DNP) og FCCP (karbonylcyanid-p-trifluorometoksyfenylhydrazon

34. Avkoplere • Ionoforer lager huller i membranen • Protonene trenger inn i matriks via disse huller og ikke via ATP syntasen • Resultat: ingen ATP syntese

35. Kopling • Kunstig lagde gradienter => • ATP syntese • Mitokondrier ekvilibreres i buffer med pH 9 og 0,1 M KCl • Det byttes til buffer pH 7 og uten KCl men med valino-mycin (K+-ionofor) tilsatt • K+ slipper ut av matriks og det dannes en ladningsgradient • Protongradienten er etablert ved hjelp av bufferen • Mitokondriene lager ATP fra ADP og Pi uten å få tilført oksiderbare forbindelser

36. Oversikt- hemmere av ETK

37. ATP syntase • Stort membranintegrert protein • Består av to deler Fo og F1 • Fo er en transmembran kanal hvor protoner passerer gjennom • F1 er et perifert protein på membranens innside • F1 utfører ATP syntesen

38. ATP syntese • ATP syntese katalysert av ATP syntasen har DG’o = 0 kJ/mol, mens hydrolyse vanligvis har DG’o = - 30,5 kJ/mol • Enzymet stabiliserer ATP mye mere enn ADP ved å binde det sterkere i det aktive setet • Forskjell i bindingsaffinitet medfører frigivelse av mere bindingsenergi (ca 40 kJ/mol) ved binding av ATP enn ADP • Dette er tilstrekkelig til å drive syntese av ATP fra ADP

39. ATP syntese • Protondrivkreften brukes også til å overføre ADP og Pi til matriks samt til å eksportere ATP til cytosol • Adeninnukleotid translokase er an antiporter som overfører ADP til matriks i bytte for en ATP som går til cytosol • Ladningforskjellen mellom matriks (neg.) og cytosol hjelper denne utveksling • Fosfat translokase, en symporter, over-fører en Pi sammen med en proton til matriks • Denne ladningsneutrale overføring favoriseres av protongradienten

40. ATP syntese • Protondrivkraften beskrives av uttrykket: DG = 2,3RTDpH + FDY • DpH = 0,75 • DY = 0,15-0,2 V (matriks er negativ) • ATP syntese står ikke i et støkiometrisk forhold til protonutpumpingen • Det er enighet om at 10/6 protoner pumpes ut for hvert elektronpar som overføres fra NADH/FADH2 til O2 • Energien fra overføring av en proton brukes til å overføre en Pi til matriks • Energien fra overføring av tre protoner brukes til fosforylering av ADP til ATP • Utbyttet er dermed 2,5/1,5 ATP per elektronpar

41. Glucose kan gi 32 ATP pr molekyle

42. Brunt fettvev • Inneholder proteinet termogenin • Termogenin danner en kanal i mito-kondriemembranen hvor protonene passerer gjennom • Det lages ingen ATP • Energien frigis som varme • Nyfødte pattedyr og dyr som går i hi bruker denne mekanisme til å holde seg varme

43. Regulering av oksidativ fosforylering • ATP produksjonen reguleres hele tiden for å møte cellens behov • Akseptor kontrol: respirasjonen reguleres av tilgangen på ADP • Massevirkningdforholdet dvs forholdet ATP / ADP Pi regulerer • Dette forholdet er normalt svært høyt dvs nesten alt er ATP • Når cellens aktivitet medfører forbruk av ATP økes tilgangen på ADP og dermed øker respirasjonen • Svært rask regulering sørger for nærmest konstante nivåer av ATP i enhver celle

44. ATP kontrollerer sin egen syntese • ATP/ADP ratioen kontrollerer alle viktige reguleringspunkter i katabolismen • ATP kontrollerer dermed sin egen syntese