第五章 分子生物学研究方法

1. 第五章 分子生物学研究方法

2. 分子生物学研究之所以从20世纪中叶开始得到高速发展，其中最主要的原因就是现代分子生物学研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 DNA分子的切割与连接 核酸分子杂交 凝胶电泳 细胞转化 核心技术 基因操作 核酸序列分析 基因的人工合成 基因的定点突变 PCR扩增等

3. 基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 • 外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达的过程. • 基因工程技术区别于其它技术的根本特征：具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。 • 本章将在回顾重组DNA技术史上主要事件的基础上，讨论DNA操作技术、基因克隆的常用载体系统以及基因的分离与鉴定等三个环节。

4. 三大成就： 1. 40年代确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质，解决了遗传的物质基础问题； 1928 Frederick Griffith &1944 OswaldAvery Transformation of Streptococcus pneumoniae Living S cells Living R cells Heat killed S cells Heat killed S cells mixed with living R cells Living S cells in blood sample from dead mouse capsule Bacterial Strain Injection Results

5. 1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA侵染细菌实验

6. 2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题； Rosalind Franklin Photographic film X-ray source Crystallized DNA Maurice Wilkins 1953- Franklin & Wilkins

7. Description of the 3-D structure of DNA Francis Crick & James Watson

8. 1958 -Matthew Meselson & Franklin Stahl proved that DNA replication in bacteria follows the semiconservative pathway Parent cell First replication Frank Stahl Second replication Conservative Model Semiconservative Model Matt Meselson

9. 3. 50年代末至60年代，相继提出了"中心法则"和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达。 Jacob and Monod

10. 但是，如果没有分离和富集单一DNA分子的技术，科学家就无法对这类物质进行直接的生化分析。

11. 两大技术保证： 3’ 5’ Ligase 5’ 3’ Restriction enzyme Restriction enzyme Ligase 1.DNA的体外切割和连接 1962年Arber 发现限制性核酸内切酶，1967Gellert发现了 DNA 连接酶DNA ligase covalently links two DNA strands

12. Herbert Boyer, Stanley Cohen 1972年获得第一个重组DNA分子 Herbert Boyer

14. 到目前为止，科学家已经几乎能随心所欲地把任何DNA分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。 重组DNA实验中常见的主要工具酶

15. 1972 - Paul Berg, Produced first recombinant DNA using EcoRI EcoRI recognition sites λ phage DNA EcoRI cuts DNA into fragments Sticky end SV40 DNA The two fragments stick together by base pairing DNA ligase Recombinant DNA

16. 仅仅能在体外利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组远不能满足基因研究的需要。 DNA片段在体外不具备自我复制能力，要想得到足够量和足够纯度的DNA，必须将它们连接到具备自主复制能力的DNA分子上（载体上），并转入寄主细胞中进行繁殖。 这就是基因克隆，或分子克隆 。

17. 分子克隆的载体----具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。分子克隆的载体----具备自主复制能力的DNA分子（vector），如病毒、噬菌体和质粒等小分子量复制子都可以作为基因导入的载体。

18. 1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。1970年Mandel和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收λ噬菌体DNA。 1972年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒DNA。 从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。

19. 1973 - Boyer, Cohen & Chang Transform E. coli with recombinant plasmid Kanamycin resistance gene Stanley Cohen & Annie Chan Tetracycline resistance gene Plasmid pSC101 Transformed cells plated onto medium with kanamycin and tetracycline E. coli transformed with recombinant plasmid Herbert Boyer Only cells with recombinant plasmid survive to produce colonies

20. 表明： （1）像pSC101这样的质粒DNA分子可以作为基因克隆的载体，从而把外源DNA导入寄主细胞； （2）像非洲爪蟾这样的高等生物的基因也可以被成功地转移到原核细胞中并实现其功能表达； （3）质粒DNA-大肠杆菌细胞作为一种成功的基因克隆体系，有可能在重组DNA或基因工程研究中发挥重要作用。

21. 2.DNA的核苷酸序列分析技术 DNA核苷酸序列分析法是在核酸的酶学和生物化学的基础上创立并发站起来的一门重要的DNA技术学，这门技术，对于从分子水平上研究基因的结构与功能的关系，以及克隆DNA片断的操作方面，都有着十分广泛的使用价值。

22. General process of gene engineering 1. 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 2. 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 3. 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛选出已经得到扩增的目的基因。

23. 5. 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，研究核酸序列与蛋白质功能之间的关系。

24. 5.2.4基因扩增 聚合酶链式反应，即PCR技术，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 DNA 聚合酶 • 具有在核苷酸底物的存在下，以一条DNA链为模板催化新链的合成 • 需要具有 3’ -OH 的引物 • 具有 5’ 到3’ 方向聚合的能力 • 通常具有 3’到 5’ 外切酶活性

25. PCR技术的原理并不复杂：

26. 一．DNA 体外扩增技术 1.  PCR反应体系 1) 基本原理 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

27. PCR原理示意图 PCR Cycle - Step 1 - Denaturation Template DNA by Heat (95oC) Target Sequence Target Sequence ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

28. PCR Cycle - Step 2 –Temperature is lowered (Tm ) and primers anneal to target sequences Target Sequence 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 2 Primer 1 3’ 5’ 5’ Target Sequence 3’ ②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

29. PCR Cycle - Step 3 -At 72 o C Taq DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated Target Sequence ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链。 3’ 5’ 5’ 3’ Primer 1 Taq DNA Polymerase Primer 2 3’ 5’ 5’ 3’ Target Sequence

30. End of the 1st PCR Cycle –Results in two copies of target sequence 每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 Target Sequence Target Sequence

31. Target Amplification No. of No. Amplicon Cycles Copies of Target 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 20 1,048,576 30 1,073,741,824 1 cycle = 2 Amplicon 2 cycle = 4 Amplicon 3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon 5 cycle = 32 Amplicon 6 cycle = 64 Amplicon 7 cycle = 128 Amplicon

32. PCR仪

33. 5.2.5 核苷酸序列分析 1968年 华裔科学家吴瑞设计出引物延伸测序策略 Sanger在它的基础之上发展了快数测定DNA的末端终止法 K Mullis完善了PCR扩增DNA方法

34. 不能和下一个核苷酸通过磷酸二酯键连接起来 5.2.5.1.Sanger双脱氧链终止法(dideoxy-termination sequencing) 原理：双脱氧（2'，3'）-核苷酸可以象2'-脱氧核苷酸那样直接掺入新合成的DNA链中，但因3’ 端不具OH基，DNA链合成至此中断。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，故可根据不同长度的DNA片段测定出核苷酸序列。

35. 3’ AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’ 添加 DNA polymerase 所有4 dNTPs 其中一种标记的ddNTP 在四个不同的反应管中各只包含一种ddNTP. ddTTP ddCTP ddGTP ddATP

36. 3’ AGCTAAAGGTACGGGAATTTCGCG 5’ T TCGAT T reaction TCGATT TCGATTT TC TCGATTTC TCGATTTCC TCG TCGA C reaction G reaction A reaction 5’ 每一管中的复制的序列都停留在ddNTPs 处

37. T C GA 反应终止后，四个反应管中的反应混合液分别进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离. 这四个反应管中延伸的寡核苷酸仅相差一个碱基. 电泳结构通过显色指示. 3’ C C T T T A G C T 5’

38. 过程：制备ss-DNA→与引物退火→分为4个反应系统→每个系统中加入dNTP（其中dATP常带同位素标记）和一种双脱氧核苷酸→DNA聚合酶定序反应→反应产物变性后电泳→凝胶干燥→放射自显影。` 该法亦适合mRNA的序列分析。 GC富集区常出现“隐影”或“停止”现象，如在反应中加入dITP（脱氧三磷酸次黄嘌呤）或脱氧三磷酸-7-脱氧鸟苷可解决GC富集区的测序。

40. 2. DNA定序的一般程序 酶法测序(Sanger)化学测序法(Maxam-Gilbert) 待测DNA片段 待测DNA片段 ↓↓ 次克隆 5’-末端标记 ↓ 筛选重组子 链分离 限制酶切 ↓ 模板增殖与纯化 ↓ ↓ 纯化标记的ss-DNA 与引物退火 ↓ ↓ 定序反应 定序反应 ↓ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 真空干燥 ↓ 放射自显影 ↓ 阅读序列和计算机录入 ↓ 核苷酸序列的分析与比较

41. 二. DNA序列测定的自动化 1. DNA测序步骤与自动化 1）模板制备 可自动化 2）定序反应 可自动化 3）凝胶电泳 自动化有一定困难：制胶，点样，电泳，凝胶干燥，放射自显影。 4）核苷酸序列阅读与计算机输入 可自动化 2.自动测序仪 Conney等人于1987年设计了不同荧光染料标记引物，然后做链终止测序，用激光扫描阅读序列。 红色引物+T反应系统（引物+DNA+dNTP+ddTTP） 黄色引物+G反应系统（引物+DNA+dNTP+ddGTP） 绿色引物+A反应系统（引物+DNA+dNTP+ddATP） 兰色引物+C反应系统（引物+DNA+dNTP+ddCTP）

43. 优点：i. 四个反应系统可合并点样，大大节省制胶和点样时间； ii. 可同时读出多个样品核苷酸序列，不需干燥凝胶和放射自显影； iii.可连续电泳，可读出较多的核苷酸序列。 缺点：无法保留原始记录, 四个反应产物点在一条道上,相互间会发生干扰, 导致读序时分辨率下降。 DNA序列分析自动化包括两个方面的内容， 一是指“分析反应”的自动化， 另一方面则是指“读片过程”的自动化。

45. 5.2.5.3.杂交测序 自从70年代末期DNA测序技术问世以来，人们已经做了大量重要的改进，但从根本原理上创新的则只有杂交测序法（sequencing by hybridization，SBH）一种。它利用一组已知序列的寡核苷酸短序列作探针，同某一特定的较长的靶DNA分子进行杂交，从而测定其核苷酸的序列。 DNA杂交测序实质上包括两个主要的步骤 首先是将待测定的靶DNA分子同一组已知其核苷酸顺序的寡核苷酸探针进行杂交，然后与那些能够同靶DNA形成完全的双链杂合分子的寡核苷酸探针做比较分析，并据此推算出靶DNA的核苷酸序列。

46. 如果将一种核苷酸顺序为5'-AGCCTAGCTGAA-3'的12-mer的靶DNA，与一组完全随机的8-mer寡核苷酸探针混合杂交，在总数为48=65 536种的8-mer探针群体中，仅有5种会与靶DNA形成完全互补的双链体分子。根据这5种发生了完全杂交作用的8-mer寡核苷酸探针之间的重叠序列的线性关系，便可推算出这段12-mer的靶DNA分子的核苷酸顺序。 当然，这只是一种理想化状态，实际上此种杂交模式要复杂得多，因为那些没有同靶DNA片段完全互补的寡核苷酸探针，也仍然会与之形成不稳定的双链分子。

47. 上图是两条长度均为17-mer的靶DNA片段I和II的杂交测序结果，两者仅在第8位碱基有不同，分别为C和T。靶DNA片段I可与1~8共8段彼此相互重叠的8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第9段8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段8-mer寡核苷酸之间各自具有7个碱基的重叠情况，可以构建出互补的DNA序列。靶DNA片段II的杂交结果表明，横跨其第8位碱基T的6段8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第1和第8两段8-mer寡聚体形成的具有末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段8-mer寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段I相比，它在第8位发生了由C碱基到T碱基的变化。上图是两条长度均为17-mer的靶DNA片段I和II的杂交测序结果，两者仅在第8位碱基有不同，分别为C和T。靶DNA片段I可与1~8共8段彼此相互重叠的8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子，但不能与第9段8-mer寡核苷酸形成完全的双链分子。根据相邻的两段8-mer寡核苷酸之间各自具有7个碱基的重叠情况，可以构建出互补的DNA序列。靶DNA片段II的杂交结果表明，横跨其第8位碱基T的6段8-mer寡核苷酸的双链体，由于含有内部的碱基错配，因此其杂交效率明显下降；但与第1和第8两段8-mer寡聚体形成的具有末端G-T错配的双链分子，其稳定性下降并不显著。与第9段8-mer寡核苷酸能杂交形成完全的双链体分子，证实与片段I相比，它在第8位发生了由C碱基到T碱基的变化。

48. （基因芯片测序)

49. 基因芯片测序流程

50. 5.2.6 DNA与蛋白质相互作用研究 5.2.6.1.  凝胶阻滞试验 凝胶阻滞试验（gel retardation assay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNA mobility shift assay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果此时DNA分子与某种蛋白质相结合，那么，由于分子量增大，它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。所以，当某个DNA片段与细胞提取物混合之后，若它在凝胶电泳中的移动距离变小了，就说明它可能已与提取物中的某种特殊蛋白质分子相结合了。