BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES

1. BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES

2. Colonizzazione cute Migrazione tratto sottocutaneo Colonizzazione punta CVC

3. Microrganismi più frequentemente isolati COMMENSALI della pelle: Staphylococcus epidermidis, S.aureus Corynebacterium spp COMMENSALI del tratto intestinale: Escherichia coli Klebsiella, Enterococcus Batteri ambientali: Pseudomonas aeruginosa Sphyngobacterium spp Stenotrophomonas spp COOMENSALE delle mucose: Candida albicans

4. 5 milioni di CVC impiantati ogni anno 250.000 infezioni associate a cateteri 12%- 25% mortalità Aumento della spesa ospedaliera da 3000$ a 56167 $ per paziente American College of Critical Care Medicine e della Society for Healthcare Epidemiology of America

5. Superficie di catetere sterile Film proteico depositato sulla superficie del CVC Superficie di catetere colonizzato da Staphylococcus epidermidis

6. ESEMPIO: Central Venous Catheters greatest risk of device-related infection infection rates of 3 to 5%. Biofilms are universally present on CVCs biofilm development: outside of the catheter or inner lumen Colonization and biofilm formation may occur within 3 days of catheterization

7. Metodi utilizzati per la determinazione quantitativa della popolazione microbica adesa a superfici rigide • Metodi indiretti: • conta UFC di batteri eluiti con mezzi fisici • colorazione batteri adesi e successivo saggio del colorante eluito • radiomarcatura • biologici • Metodi diretti: • microscopia ottica • elettronica (trasmissione, scansione) • confocale • Svantaggi presentati dai vari metodi: • impossibilità di distinguere tra cellule vive e morte • possibile alterazione integrità cellulare • possibile morte di parte della popolazione batterica • distacco non garantito di tutte le cellule • impiego di sostanze tossiche • decadimento e diluizione dell’isotopo radioattivo • necessità di curve di correlazione per ogni microrganismo

8. METODI DIRETTI • MICROSCOPIA OTTICA • MICROSCOPIA ELETTRONICA • MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE • MICROSCOPIA A FLUORESCENZA • MICROSCOPIA CONFOCALE

9. MICROSCOPIA OTTICA • SVANTAGGI E LIMITI • Non distingue Vivi/Morti • Porzioni di materiali • VANTAGGI • Facilità di esecuzione Mai diagnostica, mai predittiva, sempre complementare

10. MICROSCOPIA ELETTRONICA • SVANTAGGI E LIMITI • Non distingue Vivi/Morti • Natura del materiale • Porzioni di materiali • Artefatti • Non facile • ANALISI QUALITATIVA • NON SU BIOMATERIALI • VANTAGGI • Caratterizzazione strutture di adesione • Localizzazione antigeni • Visualizzazione di un fenomeno

11. MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE • SVANTAGGI E LIMITI • Non distingue Vivi/Morti • Solo porzioni di materiale • Non facile • VANTAGGI • Dettegli sull’attaccamento microbico • Osservazione anche del materiale opaco • SOLO QUALITATIVA

12. MICROSCOPIA A FLUORESCENZA (CTC, ARANCIO DI ACRIDINA, DAPI, RODAMINA 123) • SVANTAGGI E LIMITI • Incubazione/Preparazione del campione • VANTAGGI • Distingue Vivi/Morti con colorazioni differenziali (BacLight Live/Dead) SYTO9: COLORANTE CATIONICO LIPOFILICO CHE PENETRA ATTRAVERSO LE MEMBRANE E MARCA I BATTERI VIVENTI CON UNA FLUORESCENZA VERDE IODURO DI PROPIDIO: COLORANTE ANIONICO CHENON PENETRA LE MEMBRANE. SE LE MEMBRANE SONO DANNEGGIATE O COMPROMESSE (BATTERI UCCISI) PENETRA E MARCA CON UNA FLUORESCENZA ROSSA

13. MICROSCOPIA CONFOCALE • SVANTAGGI • Non evidenzia interazioni Interno/Esterno materiale • Solo porzioni di materiale • VANTAGGI • Illuminazione laser • Materiale opaco e trasparente

14. METODI INDIRETTI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI ADESI • Metodi di conta con distacco dei batteri • METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE • METODO DI CLERI • METODO DI SHERETZ • Metodi di conta in situ • MARCATURA CON ISOTOPI • SAGGI IMMUNOENZIMATICI • SAGGI BIOLOGICI

15. Metodi colturali Coltivazione in brodo di punta del catetere Qualitativo Svantaggi Vantaggi Non discriminante tra contaminazione colonizzazione infezione Grande semplicità Grande sensibilità Non garantito lo sviluppo di tutte le specie presenti Impossibilità di determinare se presente più di una specie Necessaria la rimozione del catetere

16. METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE Ampiamente utilizzato per cateteri venosi Semina mediante striscio su opportuni terreni solidi Rotolamento di punta del catetere su piastra per 4 volte Semiquantitativo Svantaggi Vantaggi Bassa specificità Bassa predittività Grande semplicità Facilità di esecuzione Sviluppo di: Non garantito il distacco dei batteri Microrganismi vivi <15 colonie Coltivazione della sola porzione esterna del catetere Contaminazione >15 colonie Necessaria la rimozione del catetere Colonizzazione

17. METODO DELLA SONICAZIONE Distacco dei microrganismi adesi o mediante sonicazione o vortex Coltivazione della punta e del segmento distale del catetere Semi-quantitativo (CRI) Svantaggi Vantaggi Microrganismi vivi Sensibilità alta Non garantita la vitalità ed il distacco dei batteri Sonicazione, vortex Facilità di esecuzione Non distingue tra colonizzatori parte esterna e lume <102 colonie Sviluppo di: Contaminazione Necessaria la rimozione del catetere >102 colonie Colonizzazione

18. SAGGI IMMUNOLOGICI ELISA • SVANTAGGI E LIMITI • Conoscenza del microrganismo • Espressione dell’antigene • Semi-quantitativa • Microrganismi in superficie • Antigene nella forma plantonica è espresso? • Curve di riferimento • VANTAGGI • No radioattivo

19. Metodi biologici Correlazione tra un fattore batterico (ATP, consumo di O2, produzione di CO2, ecc.) e numero di batteri • VANTAGGI • No radioattivo • Indipendente dallo stato del microrganismo (plantonico/sessile/biofilm) • Distingue vivi da morti • Nessuna manipolazione del supporto abiotico • SVANTAGGI E LIMITI • Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC

20. Contenuto di ATP e numero di batteri • SVANTAGGI E LIMITI • Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC • Rottura dei batteri non sempre efficace • VANTAGGI • Indipendente dallo stato del microrganismo (plantonico/sessile/biofilm) • Distingue vivi da morti Correspondence curves between log CFU-per-milliliter and log relative light unit (RLU) mean values

21. IL METODO BIOTIMER • Consente di determinare il numero di batteri adesi, aggregati o in biofilm, mediante un test biochimico e non mediante la classica determinazione del numero delle unità formanti colonia (UFC) • Il BioTimer utilizza un terreno di coltura contenente un indicatore di pH (rosso fenolo), che vira dal rosso al giallo in seguito all’acidificazione del terreno • Il tempo richiesto per il viraggio dell’indicatore viene correlato con il numero di cellule batteriche presenti inizialmente nel campione attraverso una curva di correlazione specifica • Il nuovo metodo consente di determinare il numero di batteri in situ, senza manipolazione del campione Ceppi utilizzati Streptococcus sobrinus ATCC33478T Streptococcus oralis ATCC35037T Escherichia coli MG1655 ATCC47076 Staphylococcus aureus ATCC6538 Pseudomonas aeruginosa PAO1

22. Streptococcus sobrinus y = -0,3056x + 8,2608 Log UFC Streptococcus oralis y = -0,301x + 9,0615 Staphylococcus aureus y = -0,5443x + 8,5446 Tempo (ore) Esempi di curve di correlazione tra tempo di viraggio dell’indicatore e numero dei batteri presenti nel campione Log UFC Log UFC Tempo (ore)

23. Metodi di valutazione dell’attività degli antibiotici in vitro 1 METODI PER DILUIZIONE in TERRRENO LIQUIDO o SOLIDO 2 METODI PER DIFFUSIONE in TERRENO SOLIDO MIC Concentrazione Minima Inibente MBC Concentrazione Minima Battericida SOLO PER BATTERI IN FORMA PLANCTONICA !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! NON IDONEO PER BIOFILM

24. Sistema per la determinazione della minima concentrazione per l’eradicazione del biofilm (MBEC) Calgary device National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)

25. APPLICAZIONE DEL BIOTIMER NELLA DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA SUSCETTIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI DA PARTE DI BATTERI ADESI IN BIOFILM A CATETERI NESSUNA MANIPOLAZIONE DEL CAMPIONE !!!!!!!!!!!!!