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分子生物学实验. 汕头大学 生物系 胡 忠 伦镜盛. 综合性实验. 实验一 利用 RAPD 技术分析植物基因组的多态性 （选做） 实验二 苦瓜功能基因 MAP30 的克隆及其原核表达的研究. 设计性实验. 实验一 特殊环境微生物宏基因组文库的构建及功能基因的筛选 实验二 利用 RFLP 技术分析不同环境微生物种群多态性 实验三 利用 DGGE 技术分析环境微生物种群的多态性. 实验一 利用 RAPD 技术分析植物基因组的多态性. 实验原理
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分子生物学实验 汕头大学 生物系 胡 忠 伦镜盛
综合性实验 • 实验一 利用RAPD技术分析植物基因组的多态性 （选做） • 实验二 苦瓜功能基因MAP30的克隆及其原核表达的研究
设计性实验 • 实验一 特殊环境微生物宏基因组文库的构建及功能基因的筛选 • 实验二 利用RFLP技术分析不同环境微生物种群多态性 • 实验三 利用DGGE技术分析环境微生物种群的多态性
实验一 利用RAPD技术分析植物基因组的多态性 • 实验原理 RAPD(Random Amplified Polymorhic DNA)技术由Williams等于1990年创立。该技术建立在PCR技术基础上。其原理与常规PCR技术基本相同，RAPD利用一系列（通常数百种）不同的随机排列顺序的寡聚核苷酸单链为引物（长度通常为10bp），对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，其扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组的DNA多态性。
RAPD技术的原理 A 物种 DNA片段插入、缺失或碱基突变 B 物种
B物种 A物种 琼脂糖凝胶电泳 DNA指纹图谱
实验流程 植物基因组DNA的提取 利用随机引物进行PCR扩增 引物的筛选 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳 DNA指纹图谱的分析
实验二 苦瓜Map30基因的克隆及其原核表达的研究 • 实验原理 根据苦瓜Map30基因的序列，设计出一对特异性引物，进行PCR扩增。扩增出来的PCR产物经限制性内切酶消化，在T4 DNA连接酶的作用下与经同样酶切的质粒载体连接，成为重组质粒。将这一带有外源DNA的重组质粒转化到宿主细胞内，并在一定条件下诱导外源DNA片断的表达。表达产物可以用SDS-PAGE、Western blotting等方法检测。
基因克隆原理 基因组DNA 质粒DNA 阳性克隆 PCR 限制性内切酶 限制性内切酶 宿主细胞 T4DNA连接酶 重组质粒
实验流程 • 外源DNA的获得 基因组DNA • 质粒载体的制备 PCR扩增 功能DNA 质粒DNA的提取 • 感受态细胞的制备 限制性内切酶消化 限制性内切酶消化 大肠杆菌细胞 T4 DNA连接酶 CaCl2法制备感受态细胞 重组质粒DNA 转化 • 原核表达产物的检测 筛选 （SDS-PAGE/ Western blotting） 外源DNA的诱导表达 阳性克隆
分子生物学常用实验技术简介及原理 • PCR技术的原理 • 质粒载体介绍 • 限制性内切酶简介 • pET原核表达系统的工作原理 • SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）技术的原理 • 蛋白质印迹（Western blotting）技术的原理
PCR技术的原理 PCR(Polymerase Chain Reaction)技术是Kary Mullis 在1985年建立起来的在细胞外合成DNA的一种方法，即利用DNA聚合酶依赖于DNA模板的特性，在附加两个引物与模板杂交之后，按碱基配对的原则经酶促反应合成DNA片断，包括模板变性、引物退火及用DNA聚合酶延伸两个引物之间的DNA的一定次数的重复循环，使包括在两个引物5’端限定的特异片断形成指数式积累。
1971年， Dr. K. Kleppe提出PCR最初的原始雏形概念，他发表了第一个单纯且短暂性基因修复复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。 • 1983年，由 Dr. Kary B. Mullis提出了PCR的构想，并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。（Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。） Fig. PCR技术的发明者：Dr. Kary B. Mullis
1969年，Thomas D. Brock 及其学生 Hudson Freeze 从美国黄石国家公园蘑菇泉底的喷泉口水样分离得到一株嗜热水生菌YT-1（ Thermus aquaticus strain YT-1）。Taq DNA聚合酶就是从T. aquaticus菌提取的热稳定性酶。 Fig. 美国黄石国家公园蘑菇泉（Mushroom Spring）
苦瓜MAP30基因扩增引物 1.上游引物 5′ cgG GAT CCG ATG TTA ACT TCG ATT TGT CGA CT（划线部分为BamHI内切酶位点，小写部分为保护碱基） 2.下游引物： 5′ tGA GCT CTC AAT TCA CAA CAG ATT CCC CAA（划线部分为为Sac I内酶切位点，小写部分为保护碱基）
质粒载体的简介 • 质粒（plasmid）是细胞染色外一种双链环状DNA分子，它随寄主细胞稳定遗传。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体（vector）。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。
如何阅读质粒图谱？ 1.复制起始位点（Ori） ：即控制复制起始的位点。 2.抗生素抗性基因（如Amp+ ,Kan+）：可以便于加以检测。 3.LacZ 基因：β-半乳糖苷酶氨基端编码基因。 4.多克隆位点（MCS）：它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。 5.核糖体结合位点/起始密码/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是AUG（起始密码）和SD序列。 6.质粒是环状双链DNA，质粒图谱上有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链。
常用载体：pBSK II 克隆载体
常用载体：pET-28a 表达载体
常用载体：T 载体（T vector） 很多DNA聚合酶(如Taq）在进行PCR扩增时会在PCR产物双链DNA每条链的3’端加上一个突出的碱基A。T载体是一种已经线性化的载体，载体每条链的3’端带有一个突出的T。这样，T载体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对，在连接酶的催化下，就可以把PCR产物连接到载体中，形成含有目的片断的重组载体。此连接产物可转化感受态细胞并进行重组克隆的筛选。
蓝白斑筛选原理 载体中引入的LacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个146个氨基酸的α-肽，可以被IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）诱导合成，新合成的肽能与宿主细胞β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码基因实现基因内互补（α互补），产生有活性的β-半乳糖苷酶，该酶能够水解X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷），生成蓝色的溴氯吲哚，使含X-gal的培养基中生长的菌落为蓝色。若有外源DNA插入LacZ中，因不能合成正确的α-肽，转化或转染的Lac缺陷菌株，用X-gal筛选，含阳性无隆载体的菌落为白色，含空载体的菌落为蓝色。
限制性内切酶简介 限制性内切酶（Restriction Endonuclease），能在合适的条件下，能识别双链DNA上特定序列并将DNA双链切开。
限制性内切酶的命名 由Smith和Nathams于1973年提出，1980年Roberd在此基础上进行了系统的分类，总规则是以内切酶来源的微生物的学名进行命名的，即属名的第一个字母大写、种名的前两个字母小写，有时还要加上株系名称的字母。如BamH I，来自淀粉液化芽胞杆菌Bacills amyloliquefaciens的H株系分离的第一种限制性内切酶，命名为BamH I。
酶切星号活力（star activity） 限制性内切酶在非标准反应条件下能够切割一些与其特异识别序列类似的序列，这种现象称星号活力。 常见诱发因素：高甘油含量、内切酶用量过大（100单位酶/μgDNA）、低离子浓度缓冲液（25mM）、高pH8.0、有机溶剂（乙醇等）、非Mg2＋的二价阳离子存在。
pET原核表达系统的工作原理 pET系统对T7RNA聚合酶水平和靶基因的转录实行多层次调控。在DE3溶源菌中的T7噬菌体基因1受控于IPTG诱导的lacUV5启动子，未诱导状态低水平转录。如果克隆基因的表达产物有毒性，可以采用带有pLysS或pLysE的宿主，pLys编码的T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的天然抑制剂，能在诱导前阻断它的转录。这样，在IPTG诱导前菌体可以快速生长。
编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7RNA聚合酶启动子(Φ10启动子）或所谓的T7 lac启动子的控制之下，lac阻抑物的结合能阻断转录起始。而IPTG能与lac阻抑物结合，解除阻抑物对转录的阻断，从而诱导外源基因的表达。
编码序列在多克隆位点插入，置于天然T7RNA聚合酶启动子(Φ10启动子）或所谓的T7 lac启动子的控制之下，lac阻抑物的结合能阻断转录起始。 IPTG能与lac阻抑物结合，解除阻抑物对转录的阻断，从而诱导外源基因的表达。 IPTG能与lac阻抑物结合，解除阻抑物对转录的阻断，从而诱导外源基因的表达。 pLys编码的T7溶菌酶是T7RNA聚合酶的天然抑制剂，能在诱导前阻断它的转录。 pET系统对T7RNA聚合酶水平和靶基因的转录实行多层次调控。 T7噬菌体基因1受控于IPTG诱导的lacUV5启动子，未诱导状态低水平转录。
SDS-PAGE技术的原理 DTT及β-巯基乙醇等还原剂，能使蛋白质分子中二硫键还原且不易被氧化，蛋白质在SDS存在下能形成SDS-多肽复合物。 在水溶液中，SDS与蛋白质结合后，改变了蛋白质原有的构象，所有的SDS-多肽复合物都具有近似长椭圆的形状，并且不同SDS多肽复合物的短轴长度趋于一致，而长轴与分子量成正比。
又知十二烷基磺酸根带有负电，使各种SDS-多肽复合物都带有相同密度的负电荷，而且复合物中SDS的负电荷量大超过了蛋白质多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子间原有的电荷差别。又知十二烷基磺酸根带有负电，使各种SDS-多肽复合物都带有相同密度的负电荷，而且复合物中SDS的负电荷量大超过了蛋白质多肽分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质多肽分子间原有的电荷差别。
这样，SDS-多肽复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率不再受蛋白质多肽原有电荷和形状的影响，而只与其分子量有关，并且在一定条件下与迁移率成线性关系，可采用此方法测定未知蛋白质的分子量。这样，SDS-多肽复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率不再受蛋白质多肽原有电荷和形状的影响，而只与其分子量有关，并且在一定条件下与迁移率成线性关系，可采用此方法测定未知蛋白质的分子量。
SDS-多肽复合物的迁移率只与分子量有关。 DTT及β-巯基乙醇等还原剂使二硫键还原 SDS-PAGE电泳 SDS-多肽复合呈短棒状和负电性。
蛋白质印迹（Western blotting）技术的原理 1.分子区带的转移和固定 蛋白质印迹法一般是将SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质分子区带通过一定的方法转移并固定到一种特殊的载体上，使之成为稳定的、经得起各种处理并容易检出的固定化生物大分子，常用的转移方法有电转移、毛细管转移等，常用载体有NC膜（硝酸纤维素膜）和尼龙膜等，它们与生物大分子都是非共价结合。
2.特异性谱带的检出 印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体、抗原的亲合反应。即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在此特异抗体的二抗上，再分别用低物直接显色，测荧光，放射自显影等方法检测出特异的抗原来。
