1 / 69

Bureau of General Communicable Diseases* Department of Microbiology, Faculty of Medicine,

Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of Vibrio cholerae O1 and non-O1 isolated from patients and environment in Khon Kaen. Waraluk Tangkanakul* Chariya Chomvarin** et al. Bureau of General Communicable Diseases* Department of Microbiology, Faculty of Medicine,

sacha-hampton
Download Presentation

Bureau of General Communicable Diseases* Department of Microbiology, Faculty of Medicine,

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility of Vibrio cholerae O1andnon-O1isolated from patients and environment inKhon Kaen Waraluk Tangkanakul* Chariya Chomvarin** et al. Bureau of General Communicable Diseases* Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Khon Kaen University**

  2. Today topics Details on Vibrio cholerae Background and research questions Objectives and scope of study Study design Methodology, results and conclusion of multiplex PCR, RAPD and disk diffusion method Overall conclusions Recommendationsfor future project

  3. Details :1. History of Vibrio cholerae • “Cholera” first mentioned by Hippocrates • more than 2000 years, • a broad spectrum of intestinal diseases • 1882, John Snow and Robert Koch first isolated • comma-shaped organisms • Kommabazillen • Since then advances in cholera research • have significantly contributed to the • understanding of the organism and the • disease caused by it -V. cholerae-

  4. Details :2. General characteristics of V. cholerae 2.1 Morphology • gram-negative curve rod, polar flagella • family Vibrionaceae • more than 200 serogroups • O1,O139 severe disease and cholera pandemics • non-O1/non-O139 • gastroenteritis, • septicemia and/or extraintestinal infection

  5. Details :2. General characteristics of V. cholerae 2.2Vibriocholeraegenome • The larger • (chromosome I) 2.96 million bps. • The smaller • (chromosome II) • 1.07 million bps.

  6. Details :2. General characteristics of V. cholerae 2.2Vibriocholeraegenome • Chr. I Contains the importance genes to essential cell functions; associated with virulence • DNA replication • Cell division • Gene transcription • Protein translation • Cell-wall biosynthesis Chr. II Plasmid; A circular piece of DNA  replicates autonomously • Drug resistance • Several DNA metabolism enzyme

  7. สถานการณ์อหิวาตกโรค จ.ขอนแก่น ปี 2544 - 2550

  8. จำนวนผู้ป่วยอหิวาตกโรค จังหวัดขอนแก่น จำแนกตามเดือน เทียบกับค่าเฉลี่ยของ 5 ปีย้อนหลัง

  9. 0 0-35.75 35.75-71.50 71.50-107.25 107.25-143.00

  10. ตามรอยหอย (แครง) Fresh food Lotus Fast food ตลาด บางลำภู Fast food บ้านไผ่ Big C Fresh food กาฬสินธุ์ DC วังน้อย มหา- สารคาม บ้าน หนองแก เหล่า นาดี ภูเวียง ชัยภูมิ บอระบือ โกสุม กาฬสินธุ์ (หมู่บ้านใกล้เคียง) ปากน้ำ อ.เมือง อ.กาญ- จนดิษฐ์ มหา- สารคาม หนองบัว- ลำภู อุบลรัตน์ ดอนโมง ชุมแพ อื่นๆ อ.ท่าฉาง สุราษฎร์ฯ กระนวน กรุงเทพฯ วังหอย ท่าข้าม บางขุนเทียน เจ๊วัฒนา ตลาด อ.จิระ 10-20 กระสอบ ทุกวัน ภุมเรียง อ.ไชยา สมุทรสาคร ตลาดมหาชัย Macro ขอนแก่น ป้าเพ็ญ โรงหนังราชา 8-20 กระสอบ ทุกวัน เจ๊แป้ง ตลาดรถไฟ 30 กระสอบ ทุกวัน ความเสี่ยง 4 และ 10 ต.ค.50 พบV.parahaemolyticus ในเปลือกหอยด้านนอก และน้ำในวังเลี้ยงหอย ไม่พบในเนื้อหอย • การขนส่ง • สุราษฎร์ฯ-สมุทรสาคร ใช้รถกะบะ • สมุทรสาคร-ขอนแก่น ใช้รถ 6 ล้อ (คันเดียวกันทั้ง 3 ร้าน) • ขอนแก่น-อำเภอ/จังหวัดต่างๆ ใช้รถประจำทาง • และรถส่วนบุคคล ไม่ได้แช่เย็น

  11. Epidemiology in Khon Kaen Thailand

  12. สถานการณ์การดื้อยาต้านจุลชีพของเชื้ออหิวาตกโรคของ จ. ขอนแก่น 1. การดื้อยาของเชื้อ V. cholerae Ogawa(แหล่งข้อมูล : ศูนย์วิทย์ฯ ขอนแก่น ) - ปี 2541 : เชื้อดื้อต่อยา Te ร้อยละ 92 ,Sxt ร้อยละ 97 - ปี 2542 : เชื้อดื้อต่อยา Te ร้อยละ 98 ,Sxt ร้อยละ 98 2. การดื้อยาของเชื้อ V. cholerae Inaba - ปี 2543 : เชื้อดื้อต่อยา Te ร้อยละ 10 ,Sxt ร้อยละ 5 - ปี 2544 : เชื้อดื้อต่อยา Te ร้อยละ 0 ,Sxt ร้อยละ 0 - ปี 2545 : เชื้อดื้อต่อยา Te ร้อยละ 0 ,Sxt ร้อยละ 0

  13. การทดสอบความไวต่อยาต้านจุลชีพของเชื้อ V. cholerae Inaba โดยศูนย์วิทย์ฯ ขอนแก่น ปี 2541 - 2549

  14. ความไวของเชื้อ V. cholerae Inaba ต่อยาต้านจุลชีพ ปี 2550 โดยศูนย์วิทย์ ขอนแก่น ( N = 3 )

  15. ความไวของเชื้อ V. cholerae Hikogima ต่อยาต้านจุลชีพ ปี 2550 โดยศูนย์วิทย์ ขอนแก่น และรพ. ศรีนครินทร์ ( N = 1 )

  16. Research questions ทำไมพบผู้ป่วยอหิวาตกโรคระบาดในบางปี ทำไมมีผู้ติดเชื้อ Vibrio cholerae non o1, non o139 เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลมากขึ้น มีการเปลี่ยนแปลงของเชื้อทางโมเลกุลอย่างไร การดื้อยาที่พบเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของเชื้ออย่างไร

  17. Details :2. General characteristics of V. cholerae 2.4 Molecular epidemiology • Sign et al; 2001 (India); clinical and environmental V. choleraeO1 and non O1 • V. choleraeO1 V. choleraenon O1 • - ctxA - 96% - 0% • - zot - 96% - 0% • - ace - 96% - 0% • - tcpA - 100% - 0% • - toxR - 100% - 96% • - stn/sto - 0% - 0% • - hlyA - 100% -100% • - ompU - 100% - 4%

  18. Details :2. General characteristics of V. cholerae 2.5 Molecular epidemiology (cont.) • Rivera et al; 2001(South America) ;environmental V. cholerae O1 and non-O1 • V. cholerae O1V. cholerae non O1 • - ctxA - 100% - 5.8% • - zot - 100% - 0% • - tcpA - 100% - 7.0% • - toxR - 100% - 100% - stn/sto - 10.5% - 28.2% • - hlyA - 100% - 97.5% • - ompU - 100% - 76.9%

  19. Way out ทำไมพบผู้ป่วยอหิวาตกโรคลดลงในบางปี ทำไมมีผู้ติดเชื้อ Vibrio cholerae non o1, non o139 เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลมากขึ้น มีการเปลี่ยนแปลงของเชื้อทางโมเลกุลอย่างไร ใช้ การหา virulence gene, pattern และ similarity ของเชื้อทางโมเลกุล โดยวิธี Random Amplification Polymorphic DNA การดื้อยาที่พบเกี่ยวข้องกับการเปลี่ยนแปลงของเชื้ออย่างไร หา เปอร์เซนต์การดื้อยา และแบบแผนการดื้อยา

  20. Objective • To detect virulence genes including ctxA, tcpA, zot, • ace, stn/sto, hlyA, ompU, and regulatory gene, toxR • in clinical and environmental V. cholerae O1 and • non–O1 performed by multiplex PCR. 2. To compare the patterns of genomic diversity among clinical and environmental V. cholerae O1 and non-O1 by RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA)

  21. Objective 3. To compare the antimicrobial susceptibility patterns of the clinical and environmental V. cholerae O1 and non-O1 strains isolated in Khon Kaen.

  22. Scope and limitation of research • Clinical and environmental V. cholerae O1 and non-O1 isolates were collected from • : Srinagarind hospital • : Khon Kaen hospital • : Aquatic environment • : water from patient’s house

  23. Scope and limitation of research (cont.) • 3. Antimicrobial susceptibility test ; interpreted • disk diffusion method • susceptible • intermediate • resistance

  24. Table 1V. cholerae O1 and non-O1 included in this study

  25. Study design Environmental samples - Aquatic environment - Water from patient’s house Rectal swab samples - Patients - Carriers (N=62) (N=174) Detection of Vibrio cholerae from specimens by culture method Detection of Vibriocholeraeserogroups bylatex agglutination V. cholerae O1 V. cholerae non-O1

  26. Study design V. cholerae O1, V. cholerae non-O1 Detection of virulence associated genes including ctxA, tcpA, zot, ace, ompU, stn/sto, hlyA and toxR Molecular typing Antimicrobial susceptibility RAPD Disk diffusion Multiplex PCR

  27. Methodology : Objective 1 (1) Multiplex PCR for detection of virulence gene and their patterns

  28. Methodology : Objective 1 (2) Multiplex PCR for detection of virulence gene and their patterns

  29. Methodology : Objective 1 (3) Multiplex PCR for detection of virulence gene and their patterns • Consist of at least three major pathogenicity islands • VPI (Vibrio pathogenicity islands/TCP islands) • CTX phage (CTX) • RTX gene clusters

  30. Methodology : Objective 1 (4) Multiplex PCR for detection of virulence gene and their patterns VPI (Vibrio pathogenicity islands/TCP islands) tcp gene clusters activates trancription of the toxT gene, essential activor for tcp gene cluster transcription • tcpP • tcpA - the major colonization factor - the receptor for CTX • toxT encoding ToxT, activate ctx and tcp gene clusters

  31. CTX phage (CTX) Methodology : Objective 1 (5) Multiplex PCR for detection of virulence gene and their patterns ctxA, B encoding the cholera toxin (CT)  cholera disease symptoms ace encoding accessory cholera toxin zot encoding zonular occluden toxin encoding transmembrane protein ToxR ; The master regulatory which is itself regulated by environment toxR

  32. RTX (repeat in toxin) gene clusters Methodology : Objective 1 (6) Multiplex PCR for detection of virulence gene and their patterns rtxA encoding the presumptive cytotoxin rtxC encoding an acyltransferase rtxB encoding an associated ATP-binding cassette rtxD transporter system

  33. Obj. 1 (7): Oligonucleotide primers, amplicon sizes, and PCR conditions used for detecting of V. cholerae ctxA, tcpA, zot, ace, ompU, toxR, stn/sto and hlyA

  34. Results : Multiplex PCR (1) M 1 2 3 4 bp 1200 1000 zot 947 bp 500 tcpA 472 bp ctxA 302 bp 100 Figure 1 Agarose gel electrophoresis of ctxA, tcpA and zot gene amplicons performed by using multiplex PCR. Lane M, 100 bp molecular weight marker ; lane 1, postive control; lane 2 and 3, V. cholerae O1 isolated from clinical specimens; lane 4, negative control.

  35. Results :Multiplex PCR (2) M 1 2 3 4 bp 1200 ompU 869 bp 1000 toxR 779 bp 500 ace 600 bp 100 Figure 2 Agarose gel electrophoresis of ace, ompU and toxR gene amplicons performed by using multiplex PCR. Lane M, 100 bp molecular weight marker; lane 1, Postive control; lane 2 and 3, V. cholerae O1 isolated from clinical specimens; lane 4, negative control.

  36. Results: Multiplex PCR (3) Table 1 The specificity of primers to other Vibrio spp. and other enteric pathogens

  37. Table 2 Distribution of virulence genes and regulatory gene in 236 V. cholerae isolates

  38. Results: Multiplex PCR (4) Distribution of virulence genes and regulatory gene of Vibriocholerae Figure 3 Distribution of virulence genes and regulatory gene in 115 clinical and environmental V. cholerae O1 and non-O1 isolates.

  39. CONCLUSION AND DISCUSSION : OBJ.1 1.Detection of clinical and environmental V. cholerae O1 and non-O1 virulence genes by PCR. 1.1 Both clinical and environmental V. cholerae O1 strains have more several virulent genes than V. choleraenon-O1. 1.2 All clinical and environmental V. cholerae O1carried ctx and tcpA, indicating that those strains from both sources can cause severe diarrhea 1.3 Most V. choleraenon-O1 (both clinical and environmental strains) carried toxRand hlyA, indicating that El tor haemolysin may play role in diarrheal disease. 1.4 Some clinical V. choleraenon-O1carried zot, ace and stn whereas some environmental strains carried stngene.

  40. RAPD Molecular typing for second objective • usefulness for epidemiology study • pathogenicity study • several molecular methods Characteristic of molecular typing method

  41. Obj 2 (1) : Methodology ofRAPD-typing of genomic diversity among clinical and environmental * DNA extraction V. cholerae O1 and non-O1 isolates from patient and environments blood agar incubated at 37C for 24 h 1 loopful of V. cholerae cells 300 l of cell lysis solution

  42. The lysate mixed and inverted Incubate for 5 min at 80 oC Added 1.5 µlRNaseA Incubate for 1 hrs. at 37 oC cool at room tempt. 100 l of protein precipitation solution mixed, incubated on ice 5 min. centrifugation 1,3000xg for 5 min.

  43. amplification condition : at 94C, 5 min. (1 cycle); 94C, 30 sec.; 47C, 30 sec; 72C, 1 min. (38 cycles); 72C, 5 min (1 cycle) amplified product Analyze by electrophoresis, 1% Nusieve agarose gel in ethidium bromide-staining

  44. Table 3 RAPD patterns of the 236 clinical and environmental V. cholerae O1 and non-O1 isolates

More Related