Hua Huang*, Fang Sun*, David M. Owen ₣ , Weiping Li‡, Yan Chen*, Michael Gale Jr. ₣, and Jin Ye*§

1. Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of very low-density lipoproteins Hua Huang*, Fang Sun*, David M. Owen ₣, Weiping Li‡, Yan Chen*, Michael Gale Jr. ₣, and Jin Ye*§ Departments of *Molecular Genetics, ₣Microbiology, and ‡Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, TX 75390-9046

2. Introduction • Le virus HCV • Virus à ssRNA (+) • Sécrété en abondance uniquement par hépatocytes • Facteurs de spécificité tissulaire ? • Une partie du virus circule lié aux VLDL

3. Complexe de réplication • Réplication virale a lieu dans une ultrastructure associée à la membrane : « membranous web » • Visualisé sur HuH7 contenant un réplicon de HCV 1b • Uniquement protéine NS • Réplication sans production de particules infectieuses Nature et composition des «membranous web» non étudiée

4. Synthèse des VLDL • Particules sphérique de 30 à 80nm • Rôle d’export tissulaire des TG • Composition des VLDL • Protéine de structure : apoB-100 et apoE • Chargement de TG via MTP dans ER + Golgi • 56% TG • 19% PL • 12% EC

5. Purification des « membranous web » • Ligné HuH7 – 5A-GFP-6 • NS5A taggé GFP en COOH terminal • Isolation immunomagnétique des vésicules par des billes Dynabeads coatées par anti-GFP • Homogénéisation des cultures cellulaires • Séparation et récupération des vésicules liées et non liées

6. Contenu en protéines viralesdes « membranous web » SDS/PAGE + Immunoblot Env 50% NS5A dans vésicules liées  50% des autres NSP Pas de contamination  10%

7. Vésicules purifiées enrichies en RNA viral et en protéines NS = COMPLEXE de REPLICATION Contenu en HCV RNAdes « membranous web » Signal uniquement dans vésicules extraites par billes taggés qRT-PCR

8. > 30% des protéines identifiées impliquées dans métabolisme lipidique Dont MTP et ApoE Caractérisation des protéines associées aux CdR des « membranous web » Vésicules attachées solubilisées  Extrait analysé par SDS/PAGE Excision des bandes  Digestion trypsine  Tandem MS

9. Données bibliographiques • Cliniquement : association dans le plasma VLDL - HCV • ApoB-100 non retrouvé • Masse moléculaire élevée (540 kDa) • Hydrophobicité globale Confirmation de la présence d’ApoB, ApoE et MTP dans les vésicules 50% de MTP 30% d’ApoE 50% d’ApoB

10. Colocalisation par immunofluorescence Colocalisation ponctiforme de NS5A et ApoB  Vésicules contenant NS5A et ApoB

11. Origine des vésicules : ER ou Golgi ? • Vésicules obtenues après immuno-isolation magnétique solubilisées puis traitées : • Endoglycosidase H : hydrolyse liaison N-sucres des protéines de l’ER • Peptide N-glycosidase F : hydrolyses toutes les liaison N-sucres ApoB sécrétée insensibles à Endo H Sensible à Endo H Vésicules contenant le CdR dérivent de l’ER

12. Sécrétion des VLDL et réplication • HuH7 – 5A-GFP-6 traitées par inhibiteur de MTP (BMS-2101038) • Inhibition chargement VLDL provoque ubiquitinilation ApoB • Cellules lavées avant incubation avec inhibiteur : éviter contamination de ApoB sécrétée Sécrétion des VLDL non nécessaire à la réplication virale

13. Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieuses • Souche HuH7 – GL avec cDNA de HCV 2a intégré dans le génome, produisant constitutivement du virus infectieux • Incubation +/- MTP Diminution HCV dans le milieu n’est pas du à une diminution de synthèse

14. Sécrétion des VLDL et libération de particules infectieuses • Souche HuH7 – GL transfectée avec siRNA dirigé contre • ApoB • GFP Immunoblot sur le surnageant de culture

15. Diminution de 50% Inhibition importante mais moins efficace que MTP Diminution de 70%

16. Discussion • Purification vésicules caractéristiques de complexe de réplication du HCV • Ces données + données cliniques suggères que les particules de HCV sont incorporées aux VLDL durant l’assemblage des lipoparticules • Test d’inhibition au MTP : sécrétion résiduelle de virus (20%) • Voie VLDL-indépendante ? • Faibles quantités de VLDL sous le seuil de détection de l’immunoblot suffisantes à la sécrétion ? • Dans intestin ApoB48 participe à formation des chylomicrons • Pas de sécrétion de HCV par l’intestion • Protéines impliquées dans l’assemblage des VLDL responsables de la spécifité tissulaire ?

17. Test des inhibiteurs de la MTP en traitement à court terme de l’infection à HCV Discussion • Production virale continuelle nécessaire à maintient du virus • Thérapeutique ciblant l’assemblage ou la sécrétion des VLDL pourrait être efficace • siRNA dirigé contre ApoB inhibe sécrétion VLDL chez la souris et le primate • RNA antisens dirigé contre ApoB et inhibiteur de la MTP utilisés en essais clinique chez l’homme dans les dyslipidémies • Traitement à court terme entraîne peut d’effets secondaires, avec accumulation de graisse hépatique faible et réversible