1 / 60

PHẦN III MỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU CỦA CÔNG NGHỆ GEN

PHẦN III MỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU CỦA CÔNG NGHỆ GEN. CHƯƠNG VIII ỨNG DỤNG KỸ CÔNG NGHỆ GEN TRONG Y HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN. I. Kỹ thuật gen trong sản xuất chế phẩm sinh học. Sản xuất insulin tái tổ hợp 1.1 Lược sử nghiên cứu insulin

salali
Download Presentation

PHẦN III MỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU CỦA CÔNG NGHỆ GEN

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PHẦN IIIMỘT SỐ ỨNG DỤNG CHỦ YẾU CỦA CÔNG NGHỆ GEN CHƯƠNG VIII ỨNG DỤNG KỸ CÔNG NGHỆ GEN TRONG Y HỌC VÀ CHẨN ĐOÁN

  2. I. Kỹ thuật gen trong sản xuất chế phẩm sinh học • Sản xuất insulin tái tổ hợp 1.1 Lược sử nghiên cứu insulin • Do các tế bào beta của tuyến tụy sản xuất, đóng vai trò chuyển hóa đường • Bệnh tiểu đường (Diabetes) do thiếu hụt insulin. • Từ năm 1922 đã tách chiết insulin từ tụy bò và lợn để điều trị tiểu đường

  3. Cấu trúc phân tử insulin người được phát hiện vào năm 1926. Năm 1955 Sanger và cộng sự đã giải trình tự và sắp xếp acid amin • 1963-1965 đã tổng hợp nhân tạo bằng con đường hóa học  đắt, không phù hợp • 1967, phát hiện cấu trúc proinsulin • 1969, phát hiện 3 dạng cấu trúc • 1978, sản xuất insulin tái tổ hợp trong E.coli • 1982, insulin được phép lưu hành ở châu Ậu. Bán ở Mỹ năm 1983

  4. 1.2 Cấu trúc gen mã hóa insulin ở người • Gen mã hóa insulin (IND) nằm trên NST số 11, trên cánh ngắn (11p) • Vùng không mã hóa chia làm 3 cụm gen ký hiệu I, II và III • Vùng mã hóa có kích thước 1430 bp. Trong vùng mã có 2 intron. • Đoạn gen mã hóa cho 4 peptid của phân tử insulin: Chuỗi peptid tín hiệu (leader), chuỗi B, chuỗi C và chuỗi A

  5. Preproinsulin is difficult for E.coli to produce • Contains a signal sequence • + A,B, C sections of protein • Signal sequence is removed after targeting to RER • Translation continues on RER (forming proinsulin) • Removal of 33 amino acids at Golgi • and S-S joining of A and B chains to form insulin

  6. Insulin • Insulin is made up of 2 chains = 51 amino acids total • A chain = 21 amino acids • B chain = 30 amino acids

  7. In reality both chains are present in the same protein

  8. 1.3 Công nghệ sản xuất insulin tái tổ hợp Nguyên lý chung bao gồm: • Tách chiết và tính sạch RNA thông tin mã hoá preproinsulin • Thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược • Sử dụng enzym giới hạn loại bỏ gen mã hóa chuỗi C, tách dòng riêng từng đoạn gen mã hóa chuỗi A và B • Tạo vector biểu hiện gen đoạn A và B

  9. - Biến nạp riêng mỗi loại vector trong E.coli • Thực hiện quá trình lên men thu protein chuỗi A-lacZ và B-lacZ • Thu riêng từng loại protein lai và thực hiện phản ứng cắt với cyanur bromid giữa a.a cuối cùng của insulin và a.a của -galactosidase • Tách và tinh sạch chuỗi A và B, sau đó tạo hỗn hợp chuỗi A và B, hình thành cầu nối disulfit và thu insulin thành phẩm

  10. Sản xuất insulin tái tổ hợp

  11. Human Insulin Production by Bacteria and cut with a restriction enzyme 6) join the plasmid and human fragment

  12. Human Insulin Production by Bacteria Mix the recombinant plasmid with bacteria. Screening bacterial cells to learn which contain the human insulin gene is the hard part.

  13. Route to the Production by Bacteria of Human Insulin One cell with the recombinant plasmid A fermentor used to grow recombinant bacteria. This is the step when gene cloning takes place. The single recombinant plasmid replicates within a cell. Then the single cell with many recombinant plasmids produces trillions of like cells with recombinant plasmid – and the human insulin gene.

  14. Route to the Production by Bacteria of Human Insulin The final steps are to collect the bacteria, break open the cells, and purify the insulin protein expressed from the recombinant human insulin gene.

  15. Route to the Production by Bacteria of Human Insulin Overview of gene cloning. Cloning animation

  16. 2. Sản xuất hormon sinh trưởng tái tổ hợp 2.1 Lịch sử nghiên cứu hormon sinh trưởng • Hormon sinh trưởng người (hGH – Human Growth Hormone) phát hiện năm 1920. Năm 1950 đã tách chiết hGH từ tuyến yên người. • 1956, hGH tách từ não bò, cừu, … dùng để chữa bệnh lùn ở trẻ em. • 1972, cấu trúc phân tử của hGH được xác định • 1985, hãng Genetech sản xuất thành công hGH có tên Protropin.

  17. Hormon sinh trưởng người hiện nay chủ yếu sản xuất bằng phương pháp tái tổ hợp gen. Có nhiều sản phẩm thương mại giúp điều trị bệnh hay giúp cho phát triển cơ bắp. • hGH là protein nhỏ, có 191 a.a. Trong phân tử có 2 liên kết disulfit • Các gen mã hóa hGH của người, bò… chuyển vào động vật như cá, lợn,…tạo động vật chuyển gen phát triển nhanh.

  18. Human Growth Hormone (HGH) (somatotropin) • HGH promotes overall body growth by increasing amino acid uptake by cells, protein synthesis and fat utilization for energy Insufficient production of HGH by the pituitary gland = dwarfism • Chubby face • “Baby fat” around waist • Unusual body properties as an adult • ~ 4 feet tall only • IQ = Normal HGH helps undersized children reach their normal height and size http://www.hopkinsmedicine.org/hmn/F01/photos/36.jpg

  19. 2.2 Cấu trúc gen mã hóa hormon sinh trưởng người • Họ gen có 5 gen mã hóa, nằm trên cánh dài NST thứ 17, kích thước 66 kb • Gen mã hóa hGH bị đột biến hoặc rối loạn, dẫn đến thiếu hụt hormon sinh trưởng, gây hội chứng lùn bẩm sinh • Gen hGH có đoạn trình tự mã hóa chuổi peptid tín hiệu không tương thích promoter của E.coli, do đó biểu hiện gen hGH tái tổ hợp trong E.coli rất yếu hoặc không hoạt động

  20. 2.3 Công nghệ sản xuất hormon sinh trưởng người TTH Bao gồm các bước • Tách chiết và tinh sạch mRNA từ tế bào thùy trước tuyến yên và thực hiện kỹ thuật phiên mã ngược • Sử dụng enzym giới hạn cắt bỏ đoạn gen mã hóa 23-24 a.a của chuỗi peptid tín hiệu • Chuyển gen mã hóa hGH vào vector biểu hiện thích hợp • Biến nạp vector TTH vào E.coli, nuôi cấy, thu sinh khối, tách chiết và tinh sạch hGH • Tế bào biểu hiện: vi khuẩn, baculovirus, nấm men, tế bào trứng chuột

  21. Pressure to use HGH to stimulate growth in youngsters who have no deficiency but whose parents want them to grow up tall. In the summer of 2003, the U.S. FDA approved the use of human growth hormone (HGH) for • boys predicted to grow no taller than 5′3″ and • for girls, 4′11″ even though otherwise perfectly healthy. If adult suffers with hypopituitarism, HGH therapy is also available as normally payable under an insurance policy.

  22. Pre-recombinant era of HGH production HGH could be purified from cadaver (tử thi) pituitary glands 8 cadavers/year for 8 – 10 years per patient Creutzfeldt-Jacob Disease (CJD) is one of the risk of using brain tissue 24 cases reported by 1993 in France from cadaver HGH

  23. Protropin (Genentech) and Humatrope (Eli Lilly) hGH therapy is very expensive, costing anywhere from $800 to $2,500 a month • Native human GH contains signal peptide • needed to direct nascent polypeptide to RER in eukaryotes • Signal peptide is bad for E.coli • (it can not synthetize this protein) • Signal sequence removed be EcoRI cleavage • Coding sequence for first 24 aa also lost in the process of removal • 24 amino acids added back by synthetic DNA linker • Expressed in E. coli successfully

  24. 3. Sản xuất interferon tái tổ hợp 3.1 Lược sử nghiên cứu interferon - Năm 1930, phát hiện gia súc nhiễm bệnh do một loại virus này, ít bị nhiễm loại virus khác. Isaacs và Linderman (1957) khi nuôi cấy phôi gà đã phát hiện 1 loại protein mới gây ức chế tái bản virus, gọi là interferon (IFN) - Trước năm 1980, sản xuất IFN từ tế bào bạch cầu người, lây nhiễm virus, sau đó nuôi trong phôi gà để tế bào bạch cầu sinh IFN  Giá thành đắt

  25. Tháng 1 năm 1980 thành công sản xuất IFN bằng con đường TTH trong E.coli • Interferon là protein hoặc glycoprotein, TLPT – 16-45 kDa. Có tác dụng ngăn cản sự xâm nhiễm của virus hoặc kìm hãm phát triển khối u. • Interferon chia làm 2 nhóm: • Nhóm 1: IFN α, IFN β, IFN ω • Nhóm 2: IFN γ kém bền trong acid

  26. General Action of Interferons are small proteins released by macrophages, lymphocytes, and tissue cells infected with a virus. When a tissue cell is infected by a virus, it releases interferon. Interferon will diffuse to the surrounding cells. When it binds to receptors on the surface of those adjacent cells, they begin the production of a protein that prevents the synthesis of viral proteins. This prevents the spread of the virus throughout the body. Interferons • Three types of interferons: alpha, beta and gamma.

  27. Type I Interferons • Type I: alpha and beta • Alpha interferons are produced by leukocytes • Beta interferons are produced by fibroblasts • Both bind to interferon cell receptors type 1 and both encoded on chromosome 9 • They have different binding affinities but similar biological effects • Viral infection is the stimulus for alpha and beta expression • Used to mobilize our 1st line of defense against invading organisms • Largest group and are secreted by almost all cell types

  28. Type II Interferon (gamma) • Bind to type 2 receptors and its genes are encoded on chromosome 12 • Initially believed that T helper cell type 1 lymphocytes, cytotoxic lymphocytes and natural killer cells only produced IFNg, now evidence that B cells, natural killer T cells and professional antigen-presenting • cells secrete IFNg also. • Gamma production follows activation with immune and inflammatory stimuli rather than viral infection. • This production is controlled by cytokines secreted by interleukin 12 and 18.

  29. IFN tái tổ hợp • Interferons are broken down into recombinant versions of a specific interferon subtype and purified blends of natural human interferon. • Many of these are in clinical use and are given intramuscularly or subcutaneously • Recombinant forms of alpha interferon include: • Alpha-2a drug name Roferon • Alpha-2b drug name Intron A • Alpha-n1 drug name Wellferon • Alpha-n3 drug name AlferonN • Alpha-con1 drug name Infergen • Recombinant forms of beta interferon include: • Beta-1a drug name Avonex • Beta-1b drug name Betaseron • Recombinant forms of gamma interferon include: • Gamma-1b drug name Acimmune

  30. How Does It Prevent Viral Replication? virus cells (Other stimuli: exogenous ds RNA, LPS, bacterial components)

  31. How Does It Prevent Viral Replication? virus interferon

  32. How Does it Prevent Viral Replication? No replication virus Inhibitory proteins

  33. 3.2 Gen mã hóa ở người và cơ chế sinh IFN • Trong tế bào người IFN-α mã hóa bởi 22 gen nằm trên cánh ngắn của NST số 9, gen mã hoá IFN-β nằm trên NST số 2 • Gen mã hóa IFN-γ nằm trên NST số 12, gồm 4 exon. Sản xuất trong tế bào lympho T

  34. Vai trò của IFN trong trị bệnh do nhiễm virus • Điều trị viêm gan và ứng dụng trong điều trị ung thư

  35. Y Y Y IL-12 Tuberculosis susceptibility genes VDR Y IFNg P2X7 IFNgR1 Y IFNgR2 STAT1 NRAMP1 iNOS IL-12Rb2 IL-12Rb1 HLA-DR2 IL-1b TNF IL-10 MBL T cell/NK cell Infected Macrophage Shown to be linked or associated with TB in more than one population Conflicting studies –both +ve and –ve associations with TB reported Single study shows association with TB Negative studies not shown – mostly not published!

  36. 3.3 Công nghệ sản xuất interferon tái tổ hợp • Sản xuất IFN-α: gây nhiễm nhân tạo virus vào tế bào bạch cầu. Sử dụng một số loại virus như Sendal, Newcastle, λ • Sản xuất IFN-β: từ nguyên bào sợi

  37. 4. Sản xuất yếu yếu tố VIII và IX tái tổ hợp • Các chất có ảnh hưởng đến sự đông máu: từ I đến XII. Trong đó yếu tố VIII và IX đóng vai trò quan trọng.

  38. 5. Sản xuất vaccin tái tổi hợp và vaccin DNA 5.1 Lược sử nghiên cứu và ứng dụng • Năm 1780 Edward Jenner phát hiện phương pháp phòng bệnh đậu mùa bằng chủng đậu với virus gây bệnh đậu bò giảm độc lực • Luis Pasteur phát minh vaccin chữa bệnh dại • Có thể chia vaccin làm 2 nhóm: truyền thống và tái tổ hợp ự

  39. Vaccination • Jenner 1796 : Cowpox/Swinepox • 1800’s Compulsory childhood vaccination • 1930’s Last natural UK case • 1940’s last natural US case • 1958 WHO program • October 1977: Last case (Somalia) Smallpox - đậu mùa

  40. No animal reservoir • Lifelong immunity • Subclinical cases rare • Infectivity does not precede overt symptoms • One Variola serotype • Effective vaccine • Major commitment by governments Smallpox

  41. Vaccin truyền thống: là vi khuẩn hoặc virus sống đã làm giảm độc lực. Nhược điểm: thời gian bảo quản ngắn, khó bảo đảm an toàn → tính độc hồi lại • Vaccin TTH: protein kháng nguyên nhờ kỹ thuật DNA. Ưu điểm: giá thành rẻ, sử dụng rộng rãi chống các bệnh do vi khuẩn, ký sinh trùng, viêm gan do virus • Vaccin DNA có hiệu quả cao trong phòng chống bệnh hiểm nghèo (ung thư, AIDS,…)

  42. 5.2 Vaccin tái tổ hợp 5.2.1 Vaccin TTH phòng chống viêm gan • Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B (HBV) được sản xuất trong nấm men S.cerevisae từ năm 1981. Bắt đầu sử dụng từ năm 1986 • Một số sản phẩm vaccin phòng chống HBV: Recombivax HB, Engeris B, Genhevac B,… được sản xuất trong tế bào nấm men và vi khuẩn

  43. The growth cycle of Hepatitis B virusChu trình sinh trưởng của HBV From Murray et. al., Medical Microbiology 5th edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,, Figure 66-5

  44. HBV vaccin sử dụng gen mã hóa protein vỏ. Protein kháng nguyên HBsAg có khả năng tạo kháng thể miễn dịch mạnh nhất. • Gen mã hóa protein vỏ gồm 3 gen: Pre-S1mã hóa chuỗi peptid gồm 128 a.a, Pre-S2 mã peptid có 55 a.a và gen S mã hóa chuỗi peptid có 226 a.a • Người ta tách riêng hoặc tổ hợp S, Pre-S1 và Pre-S2 để tạo tổ hợp vaccin khác nhau • Việt Nam là nước có tỷ lệ nhiễm HBV ở mức cao, viêm gan cấp tính 37-49 %, xơ gan có HBV 47-87 %, ung thư gan có HBV 57-80%

  45. Transcription of Hepatitis B virus Note: HBeAg (E) is encoded in C region using different start codons and is not shown From Murray et. al., Medical Microbiology 5th edition, 2005, Chapter 66, published by Mosby Philadelphia,, Figure 66-6

  46. Recombinant DNA • Single gene (subunit) S-antigen mRNA Hepatitis B vaccine raised in yeast cDNA Express plasmid S-antigen mRNA protein New Methods

  47. 5.2.2 Vaccin tái tổ hợp chống bệnh sốt rét • 300-500 nhiễm bệnh hàng năm, tử vong 1-3 triệu người. Kí sinh trùng do 4 loài có vòng đời và quá trình lây nhiễm phức tạp • Vaccin từ gen kháng nguyên Pfs-25 đang được thử nghiệm. Gen Pfs-25 được tách dòng từ Plasmodium falciparum mã hóa cho protein có TLPT 25 kDa • Đã sử dụng vaccin phòng chống viêm não, cúm gà. Đang phát triển vaccin phòng chống sốt xuất huyết, HIV/AIDS

  48. 5.3 Vaccin DNA 5.3.1 Lược sử nghiên cứu và vai trò của vaccin DNA • 1990 Wolff và cs thử nghiệm gắn một đoạn DNA vào vector biểu hiện, sau đó đưa trực tiếp vào tế bào sống  Mở ra triển vọng mới phòng chống bệnh truyền nhiễm • Bệnh Gumboro do virus gây bệnh trên gà. Năm 1996 nhiều nghiên cứu TTH gen kháng nguyên VP2 hoặc đoạn gen VP3, VP4 tạo vaccin DNA.

  49. Vaccin DNA gồm 2 loại: vaccin tập hợp gen kháng nguyên và vaccin tập hợp gen sinh kháng thể • Vaccin có nhiều ưu điểm: dễ dàng thiết kế, sản xuất, bảo quản

More Related