Цель исследования

1. Цель исследования Оценить применение современных стандартов лабораторной диагностики ревматических заболеваний в реальной клинической практике по данным лаборатории иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний ФГБУ «НИИР им. В.А. Насоновой» РАМН за 2012 г.

2. Общая характеристика больных За 2012 г. обследовано 19895 больных, из них 13863(70%) амбулаторно и 6032(30%) стационарно

3. Характеристика лабораторных биомаркеров За 2012 г. произведено 90364 иммунологических исследований (в среднем по 4,5 анализа на 1 пациента). 63,6% (57338 анализов) составили серологические тесты, связанные с определением аутоантител; 12,9% (11661 анализов) – белки острой фазы воспаления; 25,5%(21365 анализов)- другие биомаркеры (АСЛ-О, иммуноглобулины, криоглобулины, комплемент, субпопуляции лимфоцитов, гормоны, квантифероновый тест ).

4. Количество анализов аутоантител за 2012 г. (I)

5. Количество анализов аутоантител за 2012 г. (II)

6. Количество анализов аутоантител за 2012 г. (III) 4,6% 9,2% 2,8% 30% 9,1% 7,8%

7. Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа аутоантител, реагирующих с различными компонентами ядра

8. Международные рекомендации по методам определения и клиническому значению антинуклеарных антител

9. Антинуклеарный фактор (АНФ) • «Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА в сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием в качестве субстрата криостатных срезов мышиной или крысиной печени (почек), либо клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека). 2. Применение стандартизованных HEp-2 клеток предпочтительнее, так как позволяет существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы свечения ядра. При тестировании АНА методом НРИФ их традиционно обозначают как антинуклеарный фактор (АНФ). 3. Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального титра обнаружения АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлюоресценции. 4. Характер свечения отражает присутствие различных типов АНА, в определенной степени специфичных для ряда аутоиммунных РЗ.

10. Титры АНФ в норме и патологии Норма< 1:40 при использовании криостатных срезов печени или почек лабораторных животных Норма<1:160 при использовании HЕp-2 клеток человека АНФ-HЕp-2 в титре 1:40 выявляется у 25-30%, 1:80 у 10 – 15%,1:160 и выше у 5% здоровых людей. Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин. Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями имеют титры АНФ ≥1:40 в 25-30% случаев. Уровни позитивности АНФ-HЕp-2: Низко позитивные титры:1:160 Умеренно позитивные титры: 1:320-1:640 Высоко позитивные титры: 1:1280 и более Идентификация 95% больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями и здоровых лиц E.M.Tan и соавт., Arthritis Rheum 1997; 40: 1 601-1611

11. ХАРАКТЕРИСТИКА АНФ

12. Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (I) Agmon-Levin N. et al. Ann Rheum Dis 2013; doi:10.1136/annrheumdis-2013-03863

13. Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (II) Agmon-Levin N. et al. Ann Rheum Dis 2013; doi:10.1136/annrheumdis-2013-203863

14. Тестирование АНФ с помощью НРИФ при использовании в качестве субстрата HEp-2 клеток человека (содержащих 100-150 различных аутоантигенов)- «золотой стандарт» и первичный скрининговый метод определения АНА в сыворотке крови Другие скрининговые методы определения АНА (ИФА, мультиплексные технологии, устанавливающие наличие в сыворотках антител к смеси ядерных антигенов, увеличивают процент ложноотрицательных результатов и не могут заменить тестирование АНФ с помощью НРИФ Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием различных методов твердофазного анализа ( ИФА, мультиплексные диагностические платформы) должны предоставить данные о такой же или более высокой чувствительности и специфичности этих техник по сравнению с АНФ-НРИФ, апри расхождении результатов измерения АНА с клиническими данными обязательно провести повторное исследование АНА с помощью НРИФ-HЕp-2, У пациентов с положительными результатами определения АНФ рекомендуется проведение подтверждающих тестов на специфические АНА к отдельным ядерным антигенам (нДНК, Sm, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, РНП), используя методы ИФА, иммуноблота (ИБ), двойной иммунодиффузии (ДИД), контриммуноэлектрофореза (КИЭФ) и др. Некоторые типы АНА (антицентромерные, PCNA, антитела к митотическому аппарату клетки-NUMA) обнаруживаются только методом НРИФ на HEp-2 клетках, что исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью подтверждающих тестов. Методы определения АНА, анти-ДНК, анти-Sm и др. должны быть валидированы согласно национальным(CDC) или международным ( WHO) стандартам. В бланках выдачи результатов анализа следует указывать метод определения АНА. Позиция ACR и EULAR в отношении определения АНФ

15. СУБЪЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА НЕОБХОДИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ТИПОВ СВЕЧЕНИЯ ОТСУТСТВИЕ КВАЛИФИЦИРОВАННОЙ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКИ ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СВЕЧЕНИЯ В ТИТРАХ ОТСУТСТВИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СУБСТРАТОВ, РЕАГЕНТОВ, МИКРОСКОПА ЗНАЧИТЕЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО ЛОЖНО ПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ Недостатки непрямой реакции иммунофлюоресценции - основного скринингового метода определения антинуклеарных антител

16. Автоматизация и стандартизация определения АНФ методом НРИФ http://www.euroimmun.us http://www.aklides.com/ http://www.immcodiagnostics.com http://www.aesku.com

17. Клиническое значение АНФ ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ:СКВ (диагностический критерий СКВ), ССД ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ:СШ в сочетании с СКВ МЕНЕЕ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ: ПМ/ДМ ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ:ЛЕКАРСТВЕННОЙВОЛЧАНКИ, СЗСТ, АУТОИМУННОГО ГЕПАТИТА ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОГНОЗА И МОНИТОРИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ: ЮВЕНИЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКОГО АРТРИТА, ассоциирующегося с увеитом ФЕНОМЕНА РЕЙНО, ассоциирующегося с системными РЗ НЕ ИМЕЕТ ДОКАЗАННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО И ПРОГНОСТИЧЕСКОГО ЗНАЧЕНИЯ ПРИ:РА, РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ, ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, ИНФЕКЦИЯХ, ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИЧЕСКОЙ ПУРПУРЕ ФИБРОМИАЛГИИ

18. Клиническая информативность определения АНФ при СКВ • Solomon D.H., Kavanaugh A.J., Schur P.H. Evidence-based guidelines for the use of immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthr Rheum 2002;47:434-44.

19. Клиническая информативность определения АНФ при ССД • Solomon D.H., Kavanaugh A.J., Schur P.H. Evidence-based guidelines for the use of immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthr Rheum 2002;47:434-44.

20. Клиническая информативность определения АНФ при СШ • Solomon D.H., Kavanaugh A.J., Schur P.H. Evidence-based guidelines for the use of immunologic tests: antinuclear antibody testing. Arthr Rheum 2002;47:434-44.

21. Кратность определения АНФ Согласно международным рекомендациям определение АНФ в НРИФ нецелесообразно использовать для мониторирования активности патологического процесса (отсутствие корреляции большинства типов свечения, кроме гомогенного, с активностью заболевания; измерение в титрах) и может проводиться с частотой 1 раз в 6 месяцев – 1 год

22. Международные рекомендации по использованию иммунологических маркеров для диагностики СКВ

23. Иммунологические критерии СКВ

24. Стандартная панель иммунологических тестов для оценки прогноза и мониторирования активности СКВ Антитела к dsДНК Антитела к Ro/SSA Антитела к La/SSB Антитела к RNP Антитела к ФЛ Антитела к С1q C3/C4

25. Норма. ИФА < 10-20 МЕ/мл, НИФ с Crithidia luciliae - < 1:10 РИА Farr < 7 МЕ/мл. Клиническое значение Полезный тест для диагностики СКВ у пациентов с положительными результатами определения АНФ. Обязательный диагностический критерий СКВ. Полезный тест для оценки активности патологического процесса и поражения почек. Положительные результаты обнаружения антител к дсДНК не позволяют достоверно прогнозировать обострения СКВ. При других ревматических заболеваниях тестирование антител к dsДНК не полезно, так как они выявляются очень редко (≤5% случаев) и в низких титрах. Антитела к двухспиральной (нативной) днк - серологический маркер СКВ Методы определения: • ИФА-первичный скрининговый тест. • Непрямая иммунофлюоресценция с Crithidia Luciliae • РИА (тест-Farr) подтверждающие тесты Crithidia Luciliae

26. Увеличение концентрации анти-дсДНК и снижение концентрации комплемента коррелирует с тяжестью СКВ Рекомендуется определять уровень анти-дсДНК и концентрацию С3 и С4 комплементов в сыворотке при наблюдении пациентов с СКВ для оценки активности и прогнозирования развития обострений

27. Клиническая информативность определения антител к дсДНК при СКВ (ИФА) • Kavanaugh A.F., Solomon D.H. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: anti-DNA antibody tests. Arthr Rheum 2002; 47: 546-55.

28. Кратность определения антител к дсДНК Рекомендуемая частота определения антител к дсДНК составляет 1 раз в 1-3 месяца при высокой активности, 1раз в 3-6 месяцев при низкой активности

29. Антитела к Sm (Smith) антигену (ИФА) Sm антиген состоит из 5 малых ядерных (мя) РНК (U1, U2, U4, U5, U6), связанных с 11 и более полипептидами (70 kd, A, B/B′, C, C′, D, E, F, G). При СКВ антитела к Sm реагируют с B/B′ и D полипептидами, общими для U1, U2, U4/U6 мяРНП, участвующих в сплайсинге пре-мРНК. Методы определения: ИФА, ИБ, ДИД и КИЭФ. Норма: ≤ 25 ЕД /мл при использовании ИФА (зависит от рекомендаций фирмы-изготовителя коммерческих наборов реагентов). Клиническое значение: 1. Специфичный серологический маркер и диагностический критерий СКВ. 2. Не имеет пользы для оценки активности и характеристики субтипов СКВ. • Кратность определения: Рекомендуется однократное определение антител к Sm.

30. Клиническая информативность определения антител к Sm при СКВ (ИФА) • Kavanaugh A., Tomar R., Reveille J.et al., Guidelines for clinical use of the antinuclear antibody test and tests for specific autoantibodies to nuclear antigens. American College of Pathologists. Arch Pathol Lab Med 2000; 124: 71-81.