Репарация ДНК

1. Репарация ДНК

2. Репарация ДНК • Первичная структура ДНК является динамичной и подвергается постоянным изменениям.

3. Изменения в молекулярной структуре генетического материала являются повреждениями ДНК.

4. СОПОСТАВЬТЕ ЦИФРЫ: Тело человека состоит из ~1014 клеток, ядро каждой клетки содержит ~3×109 нуклеотидов ДНК, все клетки тела проходят в течение жизни человека 1016 циклов делений (и репликаций ДНК). Ошибки процесса репликации ДНК в клетках здорового человека происходят с частотой ~10-9-10-10 на 1 нуклеотид ДНК на 1 клеточное поколение. В каждой клетке при температуре тела человека от ДНК отрываются >10000 оснований (в основном пуриновых) вследствие разрывов N-гликозидных связей между основанием и дезоксирибозой – ЕЖЕДНЕВНО! Частота спонтанных реакций дезаминирования цитозина в урацил – более 100 на клетку за 1 сутки. В ходе репликации ДНК, транскрипции и других процессов постоянно рвутся цепи ДНК. И это только часть реакций деструкции ДНК, происходящих в нормальной клетке в обычных условиях! В то же время частота фиксированных наследственных изменений – мутаций генов несравнимо ниже частоты повреждений ДНК. Менее 1 повреждения ДНК из 1000 превращается в мутацию. Этот факт объясняется работой целого ряда ферментных систем, исправляющих повреждения ДНК и объединенных общим названием репарация ДНК.

5. Повреждение ДНК – это не мутация. • Мутация – это наследственное (фиксированное) изменение в нуклеотидной последовательности генома организма.

6. Репарация генетических повреждений – свойство живых организмов восстанавливать нарушения и повреждения, возникшие в ДНК в результате ошибок репликации, а также при воздействии разнообразных эндогенных и внешних мутагенных факторов.

7. ДНК- это единственная макромолекула клетки, в которой возможно устранять повреждения. • Вся информация о механизмах репарационных процессов, закодирована в ДНК. • В основе процессов репарации лежит принцип спаривания комплементарных оснований ДНК.

8. Основные повреждения ДНК

9. Индуцированный мутагенез Химические мутагены: • Аналоги оснований • Интеркалирующие агенты • Алкилирующие агенты • Активные формы кислорода • Физические мутагены: • Ионизирующие излучения • УФ-лучи

10. Тиминовый димер 6-4-фотопродукт Повреждения, вызываемые УФ-облучением: пиримидиновые димеры (на примере тиминового димера) и 6-4-фотопродукт

11. Образование транзиций в результате дезаминирования оснований В клетках млекопитающих дезаминирование цитозина происходит с частотой 1000 оснований на клетку за сутки.

12. Образование апиримидиновых и апуриновых сайтов (АП-сайтов) В каждой клетке млекопитающих за одну 20-ти часовую генерацию спонтанно возникает около 10000 апуриновых сайтов и около 500 – апиримидиновых.

13. Основные ферменты, участвующие в репарации

14. Основные ферменты, участвующие в репарации

15. Пути репарации ДНК • Репарация неспаренных оснований. • Восстановление исходной структуры. 3. Эксцизионная репарация а) Вырезание оснований б) Вырезание нуклеотидов. 4. Пострепликативная репарация а) Рекомбинационная репарация б) SOS-репарация – мутагенный или «ошибочный» путь репарации.

16. Репарация ДНК путем прямоговосстановления повреждений

17. Репарация ДНК путем прямого восстановления повреждений

18. Эксцизионная репарация у E.coli

19. Эксцизионная репарация нуклеотидов у E. coli

20. Эксцизионная репарация нуклеотидов у E.coli Белковый комплекс 2UvrA-UvrB-UvrC (эксцинуклеаза) узнает поврежденный cайт (димер), присоединяется к нему и вносит два однонитевых разрыва с обеих сторон от димера.

21. Эксцизионная репарация нуклеотидов у E.coli Короткий фрагмент длиной в 12 н. расплетается с помощью ДНК-хеликазы(UvrD) и отсоединяется.

22. Эксцизионная репарация нуклеотидов у E.coli Образовавшаяся брешь длиной 12 н. застраивается ДНК-полимеразой I (репаративный синтез ДНК).

23. Эксцизионная репарация нуклеотидов у E.coli ДНК-лигаза замыкает однонитевой разрыв

24. У эукариот система эксцизионной репарации нуклеотидов функционирует по той же схеме, что и у бактерий, но организована сложнее и работает эффективнее, по сравнению с бактериями. Эукариотическая эксцинуклеаза включает, по крайней мере 17 белков, и при эксцизии вырезаются 29 н.

25. Репарация неспаренных оснований (Mismatch repair – MMR)

26. Репарация неспаренных оснований (MMR) Перед репликацией ДНК находится в метилированной форме, вновь синтезированная цепь - неметилирована

27. Основная роль в метилировании ДНК у E.coliпринадлежит метилазеDam Репликация Метилирование

28. Репарация неспаренных оснований (MMR) С неправильным основанием связывается белок MutS, с которым затем связываются белок MutL. Это событие активирует латентную эндонуклеазу MutH. Образуется репарационный комплекс с затратой одной молекулы АТР.

29. Репарация неспаренных оснований (MMR) Белок MutH разрезает неметилированную нить ДНК по сайту GATC, который может располагаться по любую сторону от неправильного основания.

30. Репарация неспаренных оснований (MMR) Затем ДНК-хеликаза II (MutU=UvrD) расплетает надрезанную нить ДНК между надрезом и неспаренным основанием (включая его) и вытесняет ее из гетеродуплекса.

31. Репарация неспаренных оснований (MMR) Экзонуклеаза I (если это 3'-конец) или экзонуклеаза VII (если это 5'-конец) гидролизует вытесненную нить. Этот процесс нуждается в MutL и MutS. Вырезаются фрагменты порядка 1000 н. 3’ 5’

32. Репарация неспаренных оснований (MMR) Затем образовавшаяся брешь застраивается ДНК-полимеразой III в присутствии белка SSB. В завершение, ДНК-лигаза восстанавливает фосфодиэфирную связь.

33. Репарация неспаренных оснований (MMR) Экзонуклеаза I – 3’-5’-активность Экзонуклеаза VII – 5’-3’-активность Хеликаза II =UvrD=MutU dam, mutH, mutL, mutS, mutU – гены-мутаторы

34. Система MMR у эукариот организована сложнее функционирует эффективнее по сравнению с бактериями. У эукариот MMR исправляет все некомплементарные пары оснований и, кроме того, репарирует делеции или инсерции в рекомбинационных гетеродуплексах размером до 12 н. У бактерий MMR неспособна исправлять пары С*С и репарирует делеции/инсерции не более 3 н. в рекомбинационных гетеродуплексах. Ключевые белки MMR – MutL и MutS высококонсервативны, их гомологи обнаружены у всех организмов от E.coli до человека. Если у E.coliэти белки (и кодирующие их гены) уникальны, то у эукариот имеется по несколько их гомологов (паралогов). Например, у дрожжей Saccharomyces cerevisiae обнаружены 3 гомолога MutL и 6 гомологов MutS, у человека – 11 гомологов MutL и 4 MutS.Следует отметить, однако, что большинство из этих белков задействовано в коррекции неспаренных оснований в рекомбинационных гетеродуплексах.

35. SOS-репарация ДНК-пол.III 5’ 3’ 5’ • 1. Многие мутагены повреждают основания ДНК, что приводит к невозможности специфического спаривания оснований. • В результате репликация блокируется. • 3. У про- и эукариотических организмов репликационные блоки обходятся с помощью встраивания неспецифических оснований. • 4. У E.coliэтот процесс нуждается в индукции SOS-системы.

36. SOS-репарация ДНК-пол.III 5’ 3’ 5’ SOS-индукция • Ключевая роль в SOS-индукции принадлежит белку RecA. Он связывается с белком SSB и с однонитевой ДНК и образует ДНК-белковые филламенты, представляющие собой активную форму белка, обозначаемую как RecA*. • RecA* является сигналом, запускающим индукцию SOS-регулона (около 30 генов), продукты которых необходимы для выживания клетки при массовых повреждениях ДНК. • 3. В SOS-регулон входят гены UmuD, UmuC и DinB, продукты которых необходимы для «обходной» (translesion) репликации. • 4. Обходная репликация является неточной, склонной к ошибкам. В результате повышается частота мутаций.

37. SOS-репарация 5’ 3’ 5’ ДНК-пол.III О– некомплементарный нуклеотид 5’ 3’ 5’ SOS-индукция О ДНК-полимераза V (2UmuD’-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) UmuC UmuD’ RecA-ATP

38. SOS-репарация 5’ 3’ 5’ ДНК-пол.III О– некомплементарный нуклеотид 5’ 3’ 5’ SOS-индукция О ДНК-полимераза V (2UmuD’-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) Ошибки 5’ 3’ TAAGTCTGACCAC ATTCAGACCTGTG 3’ 5’

39. SOS-репарация 5’ 3’ 5’ ДНК-пол.III 5’ 3’ 5’ SOS-индукция О ДНК-полимераза V (2UmuD’-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) Ошибки 5’ 3’ TAAGTCTGACCAC ATTCAGACCTGTG 3’ 5’

40. SOS-репарация ДНК-полимераза V (2UmuD’-UmuC-RecA-ATP) Функционирует при участии белка SSB ДНК-полимераза IV (DinB) В штаммах E.coli, дефектных по генам umuD, umuCили dinBУФ-индуцированный мутагенез отсутствует SOS-система является комплексной – в неё вовлечены продукты, по крайней мере, 30 генов

41. В вилке репликации показана только цепь ДНК, несущая пиримидиновый димер. ДНК-полимераза III прекращает репликацию перед димером. За димером в вилке репликации остается участок одноцепочечной ДНК, стабилизированный белком SSB. Наличие одноцепочечной ДНК активирует белок RecA, который строит вокруг нее правозакрученную белковую спираль, создавая RecA-ДНК-филамент. RecA-ДНК-филамент выступает как ко-протеаза, способствующая саморасщеплению молекул белка LexA. Инактивация LexA индуцирует синтез белков UmuC и UmuD. Ко-протеаза RecA также способствует отщеплению части неактивного белка UmuD, превращая его в активную форму UmuD'.

42. Белки Umu образуют комплекс Umu(D’)2C, ролучивший название ДНК-полимераза V (Pol V). Pol V оказывается в районе повреждения ДНК, где был сформирован RecA-ДНК-филамент, и перед которыми «застряла» ДНК-полимераза III. Затем к свободной Pol V происходит перенос первого мономера RecA от 3’-конца филамента вместе с молекулой АТФ. В результате формируется активная форма PolV – Pol V Mut или мутасома, которая способна пройти через повреждение, вставляя напротив него произвольные нуклеотиды. Такой процесс обхода повреждения ДНК в вилке репликации называют translesion DNA synthesis – TLS. После этого комплекс ДНК-полимеразы V диссоциирует от ДНК, а ДНК-полимераза III, продолжает нормальную репликацию ДНК. Приведенные данные объясняют, почему мутант recAнеспособен к УФ-индуцированному мутагенезу.

43. Вывод: • Процессы репарации являются одним из основных механизмов поддержания стабильности генетического материала.

44. Факт: • Системы репарации не функционируют со 100% эффективностью. • В результате часть предмутационных повреждений реализуется в мутации.

45. Поддержание стабильности генетического материала необходимо не только в филогенезе для стабильного сохранения вида, но также и в онтогенезе.

46. Некоторые наследственные заболевания человека, вызванные нарушениями систем репарации Пигментная ксеродерма Нарушена эксцизионная репарация. • Клинические проявления: • дерматозы под действием солнечного света • рак кожи • неврологические нарушения • дефекты роста и развития • преждевременное старение различных систем

47. Некоторые наследственные заболевания человека, вызванные нарушениями систем репарации Трихотиодистрофия Нарушена эксцизионная репарация. • Клинические проявления: • умственная отсталость • повышенная фоточувствительность • ихтиоз (чешуйчатая кожа) • неврологические нарушения • дефекты роста и развития

48. Некоторые наследственные заболевания человека, вызванные нарушениями систем репарации Синдром Блума Подавлен репаративный синтез.Дефект ДНК-хеликазы. Высокая частота хромосомных аберраций. • Клинические проявления: • задержка роста и развития • нарушения иммунной системы • - предрасположенность к раковым заболеваниям • предрасположенность к инфекционным • заболеваниям • свето-индуцируемое поражение капилляров кожи

49. Некоторые наследственные заболевания человека, вызванные нарушениями систем репарации Телангиэктазия – расширение капилляров. Атаксия-телангиэктазия Подавлен репаративный синтез. Высокая частота хромосомных аберраций. Высокая чувствительность к мутагенам. • Клинические проявления: • неврологические дефекты (церебральная атаксия) • нарушения иммунной системы • - предрасположенность к раковым заболеваниям • прогрессирующая умственная отсталость • спонтанные хромосомные аберрации

50. У человека мутации по ряду генов репарации MMR, особенно hMLH1 (один из гомологов бактериального MutL)и hMSH2 (один из гомологов бактериального белка MutS), вызывают злокачественное перерождение клеток. Например, 60% больных неполипозным раком прямой кишки (colon) дефектны по гену hMSH2.