第五章分子生物学研究法（上）

第五章分子生物学研究法（上） ——DNA、RNA及蛋白质操作技术第二节DNA操作技术第三节RNA操作技术

目录 DNA操作技术核酸凝胶电泳 PCR技术实时定量PCR 基因组DNA文库的构建 RNA操作技术

电泳电泳电场下溶液中离子的运动电泳的迁移率电泳分子在电场作用下的迁移速率与电场强度和电泳分子本身带的净电荷数成正比

核酸凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 DNA具有重复的糖-磷酸骨架相同长度的双链DNA带有几乎等量的净电荷在一定的电场强度下，DNA的迁移速率取决于核酸分子本身的大小和构型

凝胶的分辨能力 琼脂糖凝胶 0.2-50kb 聚丙烯酰胺凝胶 1-1000bp 凝胶的浓度影响分辨能力浓度越大，分辨能力越强 20%聚丙烯酰胺凝胶分离1-6bpDNA 3%聚丙烯酰胺凝胶分离1000bpDNA 2%琼脂糖凝胶分离300bp的双链DNA 0.3%-1%琼脂糖凝胶分离大片段DNA

核酸分子的染色 常用溴化乙锭（EB）染料在紫外线下显色，含有0.05μg都能检测出 EB

核酸凝胶电泳技术的结果示意图

脉冲电场凝胶电泳 DNA的迁移方向随电场方向的周期性变化而不断改变可分离高达107bp的DNA分子

聚合酶链反应技术（PCR） 20世纪80年代，凯利·穆利斯发明该技术 1变性加热到90度 2退火降温到50度 3链的延伸加热到70度

PCR：cycle1 试管内的反应物：模板DNA PCR引物四种核苷酸适当浓度的Mg2+ DNA聚合酶

PCR:cycle2

PCR:cycle3

Taq酶的发现：栖热水生菌

实时定量PCR技术的必要性 PCR技术具有极高的敏感性，扩增产物总量的变异系数常常达到10%-30% 应用简单方法对PCR扩增的产物进行最终定量不可靠 20世纪90年代末期出现实时定量PCR 利用带荧光检测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的累计速率绘制动态变化图，从而消除了在测定终产物丰度时有较大变异系数的问题

荧光PCR仪

最简单的荧光探针：SYBRGreen 未被结合的 SYBRGreen 引物 TargetDNA SYBRGreen能与双链DNA结合， DNA越多，结合的SYBRGreen 越多，荧光越强 RunPCR 但它不能分辨不同的双链引物 PCR NewDNA 继续延伸结合了SYBR

一段单链DNA（50-150bp） 与靶DNA序列中间部位结合 Taqman探针 5’端带有短波长荧光基团 3’端带有长波长荧光基团 5’ 3’ 两个荧光基团由于距离靠近，在荧光共振能量转移（FRET）作用下会发生荧光猝灭

Taqman探针：起初无荧光 引物 5’ 目的DNA 3’ 3’ 5’ 引物激发光加入探针进行PCR 5’ 新合成的DNATaq聚合酶激发光 3’

激发光 新合成的DNA Taq聚合酶延伸被释放出的染料发出绿色荧光激发光短波长的荧光基团所产生的荧光强度直接反映被正扩增的靶DNA总量探针DNA被Taq酶降解 Taq酶具有核酸外切酶活性

实时定量PCR技术的应用：分析未知样品的量 a)扩增曲线：7个标准品和一个未知样品（带三角）的扩增曲线，随着循环数的增加，代表PCR产物总量的荧光强度增加 b)标准曲线：纵坐标是每个标准品中所含DNA总量，横坐标是每个标准品达到设定阈值（a图中虚线）所需的循环数

基因组DNA文库构建 基因克隆把某种生物的基因组DNA切成适当大小，分别与载体组合，导入微生物细胞，形成克隆基因组文库基因组中所有DNA序列的克隆的总汇用于分离特定基因片段、特定基因结构、研究基因表达调控等一般切成20kb 常用λ噬菌体载体

29 基因组DNA文库构建总DNA 切割纯化弃去过长和过短的 1.制备大小合适的随机DNA片段 2.将片段与载体连接 3.转化到大肠杆菌中 4.筛选出含有靶基因的克隆 λ-噬菌体弃去中间片段连接噬菌体感染大肠杆菌基因文库

目录 DNA操作技术 RNA操作技术总RNA的提取 mRNA的纯化 cDNA的合成 cDNA文库的构建基因文库的筛选

RNA操作技术 真核生物DNA含大量冗余序列 mRNA反转录得到的cDNA （complementaryDNA）不含冗余序列 RNA分子敏感脆弱，自然状态下难以扩增，为研究mRNA包含的基因信息，一般将其反转录成双螺旋cDNA 高质量的cDNA文库代表了生物体某器官或组织mRNA中所含的全部或大部分遗传信息

Trizol：异硫氰酸胍和苯酚 可迅速破坏细胞结构，使细胞核和细胞质中的RNA释放出来，使RNA和核糖体蛋白分离除去蛋白质和DNA 总RNA的提取组织加入Trizol研磨裂解加入氯仿离心分层水相转移入新管，异丙醇沉淀RNA 离心 70%乙醇洗涤离心高质量的RNA 纯化，使RNA沉淀成固体

OD260 OD260/OD280=1.8~2.0,纯度高 OD260=1,浓度为40g/mL OD280

RNA的浓度和纯度的测定——琼脂糖凝胶电泳 28S和18SrRNA的条带亮度比为2:1且分布均匀时，RNA较完整

mRNA的纯化 总RNA 加biotin-polyT 真核细胞mRNA的特征 5’帽子m7G 加streptavidin-PMP 3’polyA尾巴磁化洗脱

cDNA的合成 (a)第一条链的合成，以mRNA为模板，用oligo(dT)为引物，加反转录酶 (b)加入RNA内切酶，除去mRNA (c)第二条链的合成以cDNA第一条链为模板，以Rnase H切割的小片段RNA为引物，加 DNA聚合酶 (d)第二条链的合成结束 (e)加上接头

cDNA的合成 需要活性较高的反转录酶及甲基化dCTP 甲基化dCTP保证新合成的链被甲基化修饰，防止构建克隆时被限制性内切酶切割 cDNA两端要加上不同内切酶所识别的接头序列保证双链DNA插入的方向性

定向cDNA的合成：1/2 接头及引物序列无RNaseH活性的反转录酶 5’-甲基dCTP、dATP、dGTP、dTTP XhoI RnaseH DNA聚合酶I XhoI

定向cDNA的合成：2/2 XhoI EcoRI接头 T4DNA连接酶 EcoRI XhoI XhoI EcoRI XhoI限制性核酸内切酶 EcoRI

cDNA文库的构建 切割位点用四碱基特异性的限制性内切酶部分消化 DNA片段，有的仍有切割位点细菌克隆每个细菌都带有不同片段的DNA 将DNA克隆进质粒DNA 质粒DNA 细菌转化

cDNA文库的构建 cDNA的长度0.5-8kb 载体：质粒载体和噬菌体类载体完整的cDNA文库包含大于5*105的独立克隆

基因文库的筛选 含义通过某种特殊方法从基因文库中鉴定出含有所需重组DNA分子的特定克隆的过程筛选方法核酸杂交法 PCR筛选法免疫筛选法

核酸杂交法 盖上硝酸纤维素膜培养基上的菌落移去硝酸纤维素膜裂解、中和去除细菌蛋白挑出阳性克隆保存母板 32P标记探针放射自显影图像杂交 DNA印迹

PCR筛选法 需获得基因特异性引物将整个基因文库保存在多孔培养板上用设计好的基因探针对每个孔PCR筛选，挑出阳性的孔对阳性的孔再稀释到次级多孔板中PCR筛选重复稀释重复筛选直到与目的基因对应的单个克隆

49 免疫筛选法文库铺于E.coli 形成噬菌斑从保存板上挑出阳性噬菌斑转移到硝酸纤维素膜吸收λ噬菌体中表达的外源蛋白保存原板，加入一抗筛选膜上的噬菌斑印迹洗去未结合的抗体加入酶偶联的二抗加底物显色一抗：第一抗体，识别目标蛋白二抗：抗体的抗体，能增强信号，增加该方法的灵活性

第五章 分子生物学研究法（上）