第五章 噬菌体载体和柯斯载体

1. 第五章 噬菌体载体和柯斯载体

2. 1 2 3 4 5 6 第一节 噬菌体的一般生物学特性 1.噬菌体的概念 专门侵害细菌和放线菌等微生物的病毒称为噬菌体（phage）。 从形态学角度又可将其分为三种不同的基本类型。 • 有尾部结构的二十面体型：1、2、3群都有尾部，1群具有收缩性的尾鞘，2群有长的非收缩性的尾部，3群的尾部很短， • 无尾部结构的二十面体型：4、5两群没有尾部，两者的区别是4群外壳顶端蛋白质衣壳粒较大，5群则较小， • 线状体型：6群为纤线形的噬菌体，

3. 病毒基本结构： DNA（或RNA）+ 外壳蛋白 感染细菌的病毒，称为噬菌体。 分类（根据病毒与宿主的关系）： 温和性病毒： 溶原性增殖→构建病毒载体 烈性病毒： 溶菌性增殖→改造后

4. 噬菌体的结构特点 • 噬菌体的构造形式如图,头部呈现六角晶柱形，经过染色处理和高度放大，可观察到头部呈20面体的结构，由蛋白质组成其外壳，内含核酸。 • 尾部由一个中空的管状体尾髓和可收缩的蛋白质尾鞘所组成。与头部相接处呈现收隘部分，称为颈部。尾端具有六边形的基片，其上生出六个刺突，并缠绕着六根细长的尾丝。

5. 噬菌体的化学成分 噬菌体的化学组成，绝大部分是核酸和蛋白质，占病毒粒子重量的90%以上，其中核酸占40%～50%。 噬菌体按核酸类型分有DNA和RNA噬菌体。一般多为DNA噬菌体，但近年来发现有不少噬菌体所含的核酸是RNA。 噬菌体中核酸链有单链的也有双链的，故有双链环型DNA,单链环形DNA,单链线型DNA,单链线型RNA等多种形式。 • 1、2、3三群由双链DNA组成； • 4、6群为DNA单链； • 5群为RNA单链。 • 某些噬菌体的核酸中含有异常碱基，如大肠杆菌T系偶数噬菌体，无胞嘧啶而代之以5-羟甲胞嘧啶。某些枯草菌噬菌体的DNA中无胸腺嘧啶而代之以尿嘧啶或羟甲基尿嘧啶。

6. 二．噬菌体的感染性 感染效率高得惊人，如：一个噬菌体颗粒经四次感染，可使数十亿细菌致死。 将少量的噬菌体颗粒加入高浓度的细菌培养物中，在第一次裂解前涂板，细菌的裂解反应，以最初被感染的细胞所在的位置为中心，慢慢向四周扩散，最后在琼脂糖平板上形成大量的噬菌斑。 噬菌斑，即感染的细菌细胞被噬菌体裂解之后留下的空斑。

7. 噬菌体对寄主细胞的感染作用，是一种相当复杂的生理生化过程。噬菌体对寄主细胞的感染作用，是一种相当复杂的生理生化过程。 噬菌体DNA盘旋成团，被紧密地包裹在由蛋白质外壳组成的头部结构内。而当噬菌体同敏感的细菌细胞接触时，首先是它的尾部便会粘着到细胞壁上，与此同时，尾部蛋白质发生收缩作用，迫使头部中的DNA注入到被感染的细菌细胞中去。 一旦噬菌体的DNA注入到细胞内之后，在细菌RNA聚合酶的作用下，它们所编码的噬菌体特有的基因便被转录形成相应的RNA分子，后者又利用细菌核糖体转译成噬菌体蛋白质。 在噬菌体感染的早期阶段，某些由噬菌体编码合成的蛋白质，会使细菌的DNA降解成单核苷酸。这样，细菌赖以进行增殖所必须的全部遗传信息，便将丧失殆尽，而最终导致死亡。有些噬菌体带有编码RNA聚合酶的基因，因此，这样的噬菌体不必依赖于寄主细菌的聚合酶，就能使自身编码的基因合成出信使RNA。还有许多噬菌体，编码有控制自身DNA复制的基因，而且还能利用由细菌DNA降解释放出来的游离的单核苷酸作原料，合成自己的DNA。当噬菌体的拷贝数高达上百个之后，几分钟内，噬菌体的其它基因也就开动起来，合成出新的头部及尾部蛋白质。头部蛋白质组装成头部，并把噬菌体的DNA包裹在其内，继而再同尾部蛋白质连接起来，形成子代噬菌体颗粒。最后，噬菌体产生出一种特异性的酶，破坏寄主细胞壁并伴随发生溶菌作用，使子代噬菌体颗粒释放出来。

8. 吸附 注入 合成 组装 释放

9. 3. 噬菌体的溶菌生命周期 溶菌周期：产生大量子代噬菌体颗粒 噬菌体生命周期 溶源周期：噬菌体DNA整合到寄主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分 溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。 溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。 只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。 大多数噬菌体的生命周期为20-60分钟

10. 噬菌体感染的基本过程是： ①吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上。 ②注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。 ③转变：被感染的细菌细胞的功能发生变化，成为制造噬菌体颗粒的场所。 ④合成：功能发生了转变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。 ⑤组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体的颗粒，这个过程也叫做噬菌体的形态建成。 ⑥释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。

11. E.coli T4噬菌体的生命周期（以分钟记） t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒

12. 4. 噬菌体的溶源生命周期 （1）基本概念 • 温和噬菌体（teemperate phageh）：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体，叫做温和噬菌体。 • 溶源性细菌（lgsogen）：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌叫做溶源性细菌。如果有某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能够完成其溶菌周期，故含有这种噬菌体的细菌叫做缺陷性的溶源性细菌。 • 溶源化（lysogenization）：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之形成溶源性细菌的过程，叫做溶源化。 • 整合（integrAtion）：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA之中，便叫做瞄合的噬菌体DNA。这种噬菌体DNA组入细菌染色体DNA的过程，称为噬菌体DNA的整合或插入。 以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA，叫做非整合的噬菌体DNA。 • 原噬菌体（prophage）：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNA，叫做原噬菌体。原噬菌体中如有某些基因缺失了，便称之为缺陷性的原噬菌体。

13. （2）溶源周期的主要特征 已知存在两种不同类型的溶源周期，其中最普遍的一种是以λ噬菌体为原型，它具有如下一些主要特性： ①噬菌体的DNA分子注入细菌细胞。 ②经过短暂的转录期之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭。 ③噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体。 ④细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。

15. （3）超感染免疫性 溶源性细菌有两个重要特点：　 第一，溶源性细菌不能够被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染。溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。　 第二，经过许多世代之后，溶源性的细菌便能够开始进入溶菌周期，这个过程叫做溶源性细菌的诱发。在诱发过程中，噬菌体基因组以单一DNA片段的形式从寄主染色体DNA上删除下来。

16. 五．重组噬菌体的分离 以噬菌体DNA分子为载体，克隆含有目的基因的外源DNA片段，若不导致重要的噬菌体基因的失活，插入的外源DNA片段会随着噬菌体DNA分子一起增值。利用32P标记的特异性探针，作噬菌斑放射自显影杂交，可检测出含有重组DNA分子的阳性斑点。

17. 分离重组体噬菌体的基本过程： 使用无菌消毒的金属接种针，粘着少量的噬菌体颗粒，转移到新鲜的细菌培养基中，使其在感染的细胞内大量地增殖。 采用密度梯度离心法，便可非常容易地纯化出噬菌体的颗粒。

18. 噬菌体的监测方法 噬菌体是极微小的微生物，通常在光学显微镜下不能看见，在人工培养基上又不能生长。所以，对噬菌体的监测只能用间接的方法进行。这些方法主要是根据噬菌体的生物学特性而设计的。 • 第一，噬菌体对寄主具有高度的特异性，可利用敏感菌株对其进行培养； • 第二，噬菌体侵染宿主细胞后可引起裂解，通过观察在含有敏感菌株的琼脂平板上接种噬菌体培养后是否出现噬菌斑，或是观察在含敏感菌的液体培养基中培养物是否变清来进行判断。 常用的方法有载片快速检测法、单层琼脂法和双层琼脂法。

19. λ噬菌体的基因组的结构和用途 λ噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12 nt，感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48531bp，含50多个基因。

20. 第二节 λ噬菌体载体 研究历史： • 伴随分子生物学、分子遗传学的创立和发展过程。 • DNA复制机理的阐明、转录的终止作用、连接酶和解旋酶的发现、位点特异的重组作用、SOS修复机制等，均是以噬菌体为材料取得的重要研究成果。 • 构建的多种噬菌体载体，广泛用于基因克隆、基因文库的构建等，是基因工程中不可缺少的实验材料。 大肠杆菌双链DNA噬菌体

21. 已定位的λ 噬菌体基因有61个 λ 噬菌体的必要基因：参与了噬菌体生命周期的活动，占一半左右 λ 噬菌体的非必要的基因：被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能 • λ 噬菌体载体的优点： • 溶源周期中，随寄主细胞一起复制； • 生物学特性及遗传背景清楚； • 寄主范围更狭窄，安全 除λ 噬菌体载体和柯斯质粒载体外，还有单链DNA噬菌体载体，如M13噬菌体载体。

22. 1 λ噬菌体的分子生物学概述 λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48 502bp，两端各有12个碱基的5`凸出黏性末端是互补的。进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。 λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期。

23. （1） 噬菌体基因组的结构 λDNA (48.5kb) ，噬菌体中：线性，宿主细胞：环状(cos位点) Cos位点：由粘性末端结合形成的双链区段

24. 左侧区：蛋白合成所需基因 右侧区：调控成分 2、λ噬菌体基因组有基因50个以上 必须基因 中间区：与重组有关 非必要基因

25. 3、 限制性核酸内切酶位点: 56种 λ噬菌体DNA的核酸内切限制酶的限制图（Kb）

26. 4、 λ噬菌体的生长途径 溶菌生长途径 溶原生长途径→某种胁迫条件下→合成six 基因产物→λ DNA脱离细菌染色体→溶菌 • λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因（OL, OR)之间的相互作用来决定的。 • 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。

28. 2. 载体的构建及其主要类型 A,构建依据 1、λ噬菌体是一种温和噬菌体 2、能承载较大的外源DNA片段 λDNA头部可包装约36.4～51kb(自身的75%～105%)，且约有20kb λDNA可缺失（生长非必需） 3、在λDNA上有多种限制性内切酶位点 B,构建的基本策略与技术路线 • 策略:切去部分非必需区，删掉多余的限制性内切酶位点，插入选择性标记基因，建立体外包装系统。

29. 技术路线 1、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点 选定一种酶，以g t WES – λ β为例，EcoRI（如图）。 （48.5kb） λDNA E co R I 6个片段 其中： B片段是λ噬菌体生长非必需的； C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径； E片段去掉min5序列（2.6kb）。 两端E coR I别点经点突变或甲基化处理，即得g t WES–λ β：（48.5-5.5-2.6 = 40.4kb）

30. 克隆能力： 替换B： 最大：51-(40.4-4.9)=15.5kb 最小：36.4-(40.4-4.9)=0.9kb 实际应用时克隆能力略有出入（p109,表3-5） 2、在λDNA的非必需区内插入选择标记基因 （1）取代red和gam基因 外源DNA取代 获Spi-表型 在P2噬菌体溶原性细胞中能生长 野生型λ噬菌体(Spi+表型) 在P2噬菌体溶原性细胞中不能生长 局限性：只能以P2噬菌体溶原细胞作为受体 （2）最常用的筛选标记：Lac Z基因

31. 3、建立重组λDNA分子体外包装系统 体外重组DNA分子必须经体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。 野生型λ噬菌体感染的细胞中无多余的外壳蛋白。 D-（D基因缺失噬菌体）→受体细胞→积累除D蛋白以 外所有蛋白质 E-（E基因缺失噬菌体）→受体细胞→积累除E蛋白以 外所有蛋白质 混合 D、E互补 包装λDNA分子 → λ噬菌体 如:菌株BHB2688(E- )+ BHB2690(D-)

33. λ噬菌体载体主要有如下特点： (1)筛选简便； (2)可克隆的片段大，最大可达23 kb，而质粒最大仅10 kb左右； (3)转化效率高。

34. λ噬菌体载体的主要类型：插入型载体和替换型载体λ噬菌体载体的主要类型：插入型载体和替换型载体 1.插入型载体：外源的DNA克隆后会使噬菌体的某些生物学功能丧失效力的载体 分：免疫功能失活的插入型载体 β-半乳糖苷酶失活的插入型载体 2.替换型载体：在λ噬菌体基础上改建的，在其中央部分有一个可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆载体

37. 4. λ噬菌体克隆载体的应用 建立c DNA基因文库 克隆外源目的基因 5.重组λDNA分子的体外包装（自学） 注意：λ噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb ~ 52kb。 体外包装：λ噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白

38. 几种常用的噬菌粒载体的一般特征

39. pUC118(MCS) pUC119(MCS) pUC118和pUC119噬菌粒载体的分子结构

40. 噬菌粒载体的优点 （1）具小分子量的共价、闭合、环状的基因基因组DNA，可克隆高达10 kb的外源DNA； （2）有ampr 等基因作为选择记号； （3）拷贝数高； （4）存在多克隆位点,可克隆达10 kb的外源DNA； （5）可用组织化学显色反应筛选重组子； （6）具质粒复制起点，在无辅助噬菌体存在下，克隆外源基因可按质粒一样复制； （7）有单链噬菌体复制起点，在有噬菌体辅助感染的宿主细胞中，可合成出单链DNA拷贝，并包装成噬菌体颗粒分泌到培养基中。 (8)可直接对克隆的基因进行核苷酸测序。

41. 第三节 柯斯质粒载体 （一）构建策略 由质粒pBR322和含cos位点的λDNA片段组装成的载体，即cosmid

42. （二） cosmid的特征 1、环形双链DNA分子,　≤36.4kb,　一般＜10kb 2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制 3、含有一个cos位点 A蛋白cos末端→体外包装成为噬菌体，但不含λ噬菌体溶菌生长途径、溶原生长途径和DNA复制系统，不会产生子代噬菌体 4、cosmid较小，可承载更大的外源DNA 若cosmid为6.5kb，则可承载44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。 因此，cosmid克隆广泛用于构建基因组文库。

43. （三）使用cosmid载体的基本程序 利用cosmid的质粒性质，可按质粒操作转化受体细胞 利用cosmid的λ噬菌体性质→转导受体细胞（下图）

44. 部分柯斯质粒的基本特性

45. 柯斯质粒载体的特点： （1）具有λ噬菌体的特性（但因不含λ噬菌体的全部必需基因，因此不能通过溶菌周期，无法形成子代噬菌体颗粒）； （2）具有质粒的特性（有质粒复制子及抗菌素基因）； （3）具有高容量的克隆能力（本身仅5-7kb, 克隆极限可达45kb左右）； （4）具有与同源序列质粒进行重组的能力。 广泛应用于基因组DNA文库的构建。

46. 柯斯克隆（cosmid cloning） 理论依据是： 1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。 2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。 3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。

47. (如EcoR I) 38kb~52kb 应用柯斯质粒作载体构建基因组文库的一般程序

48. 第四节 单链DNA噬菌体载体 （一）M13 DNA 丝状噬菌体，内有一环状单链DNA分子（“+”链DNA） 大小：6.4kb 结构：10个区　 　　　基因间隔区（IS区） 含复制起始位点及可插入外源DNA的位点

49. （二）M13DNA复制和M13噬菌体增殖　 M13 DNA“+”链进入雄性大肠杆菌→合成“-”链→产生双链M13 DNA（复制型DNA或RF-DNA）→按环状双链DNA方式复制，同时以“+”链DNA为模板转录包装蛋白 →RF-DNA达200拷贝时，单链DNA特异结合蛋白与“+”链结合而阻断合成“-”链 →结果只能以“-”链为模板合成“+”链 →“+”链DNA被包装蛋白包装成新的M13噬菌体 →挤出受体细胞 →宿主细胞不被溶菌。