Молекулярная биология для биоинформатиков

1. Молекулярная биология для биоинформатиков • Академический университет • Ефимова Ольга Алексеевна

2. Лекция № 10 Эпигенетика «Генетика предполагает, а эпигенетика располагает». P. Medawar & J. Medawar

3. Центральная догма молекулярной биологии: ДНК ------ РНК ------- БЕЛОК Генотип----------------фенотип ДНК ответственна за хранение, передачу и реализацию наследственной информации

4. Доимплантационное развитие человека День 1. Стадия зиготы День 2. Эмбрион в стадии дробления 4 бластомера День 3. Эмбрион на стадии дробления 8 клеток. День 4. Морула. 4 День 5. Бластоциста

5. Классификация стволовых клеток человека в соответствии с потенциалом к дифференцировке (Filip et al., 2004)

6. Разные судьбы, функции, морфология, «способности» клеток при одинаковом генотипе

7. Классическая генетика и генетика развития: Изучение связи между изменчивостью генотипа и фенотипа в онтогенезе. Конрад Уоддингтон (1905-1975) Эпигенетика в дополнение к генетике: «исследует явления, при которых генетическая изменчивость не ведет к изменениям фенотипа, а фенотипическая изменчивость, в свою очередь, не всегда может быть объяснена нарушениями генотипа» (Jablonka, Lamb, 2002). Предмет эпигенетики «Исследование причинных взаимодействий между генами и их продуктами, приводящих к формированию фенотипа» (Waddington, 1942). Генотип + эпигенотип = фенотип

8. Эпигенетическое наследование В более общем смысле, предметом эпигенетики являются явления, связанные с развитием различных фенотипов клеток или организмов на основе одного генотипа. В более узком смысле эпигенетика – раздел генетики, который изучает наследуемые изменения активности генов во время развития организма или деления клеток. Эпигенетическое наследование – наследование паттерна экспрессии генов.

9. Эпигенетическая регуляция - наследственные и ненаследственные изменения в экспрессии конкретного гена без каких-либо соответствующих структурных изменений в его нуклеотидной последовательности. Эпигенетические явления: импринтинг, эффект положения, особенности структурно-функциональной организации хроматина определенных хромосомных локусов, влияющие на экспрессию генов, интерференция РНК.

10. ДВА ВИДАИНФОРМАЦИИ В ГЕНОМЕ Генетическая – закодированная в ДНК программа создания живого организма Эпигенетическая (динамическая)– как, где и когда должна быть реализована генетическая информация. Каждый вид информации обеспечен своими системами: Кодирования Хранения Передачи

11. генетические эпигенетические Изменения • Необратимы (мутации) • Изменения первичной структуры ДНК • Стабильно наследуемые • Обратимы • Не затрагивают изменений первичной структуры ДНК • Бывают долговременные и кратковременные

12. Молекулярные основы эпигенетики Метилирование ДНК Модификации гистонов Эпигеном - это совокупность всех эпигенетических маркеров, обусловливающих паттерн экспрессию генов в данной клетке.

13. Посттрансляционные модификации гистонов

14. Гистоны Н2А, Н2В, Н3 и Н4 формируют октамерные структуры, вокруг которых закручивается нить ДНК, образуя таким образом нуклеосомы

15. Структура нуклеосомы Аминокислотые остатки гистонов могут подвергаться пост-трансляционным модификациям: ацетилированию, фосфорилированию, метилированию. Модификации аминокислотных остатков гистоновых белков происходят, в основном, в N-терминальных участках, которые расположены за пределами компактного октамера и подвергаются действию различных клеточных сигналов

16. В зависимости от типа и сайта модификаций аминокислотных остатков, каждая нуклеосома имеет свой «гистоновый код», регулирующий активность транскрипции

17. Ацетилирование и деацетилирование гистонов • ацетилирование связано с активацией транскрипции • белки, осуществляющие ацетилирование - гистоновые ацетилтрансферазы (НАТ); донор ацетильной группы – ацетил коА • белки, осуществляющие деацетилирование – гистоновыедеацетилазы (HDAC) • Модель модификации гистонов: • ДНК-связывающиеся активаторы привлекают НАТ для ацетилирования нуклеосомных гистонов, а репрессоры привлекают HDAC для деацетилирования гистонов. Эти события приводят к изменению структуры нуклеосом и активации или репрессии транскрипции соответственно.

18. Эффект ацетилирования – ослабление связи между ДНК и гистонами из-за изменения заряда, в результате чего хроматин становится доступным для факторов транскрипции Сайты ацетилирования: аминогруппы лизиновых остатков в составе боковой цепи гистона

19. Фосфорилирование и дефосфорилирование гистонов • фосфорилирование связано с активацией транскрипции • белки, осуществляющие фосфорилирование – протеинкиназами; донор фосфата – АТФ • белки, осуществляющие дефосфорилирование – фосфатазы Сайты фосфорилирования: гидроксильные группы серина, треонина и тирозина. В результате фосфорилирования увеличивается негативный заряд.

20. Метилирование гистонов • Метилируются • Лизин (моно-, ди- и триметилирование) • Агринин (моно- и диметилирование) • Метилирование не приводит к изменению заряда модифицируемого остатка • Эффекты метилирования в зависимости от сайта модификации и количества метильных групп: • Репрессия транскрипции • Активация транскрипции Регуляция транскрипции через молекулы-эффекторы

21. Метилирование лизинов Осуществляют лизиновые метилтрансферазы - НКМТ SET-домен Донор метильной группы – S-аденозилметионин (SAM) 6 наиболее хорошо описанных сайтов метилирования: на гистоне Н3 (К4, К9, К27, К36, К79) на гистоне Н4 (К20) Деметлирование лизинов LSD1 удаляет метильные группы с Н3К4 JHDM1 – H3K36me1 и me2, JHDM2A – H3K9m1 и me2, JHDM3A – H3K36me3, JMJD2A – H3K9me3.

22. Роль модификаций в регуляции транскрипции

23. Метилирование ДНК и связанные с ним процессы

24. H H N CH3 4 N 3 5 N 2 6 1 O Молекулярные основы эпигенетики RobinHolliday Б.Ф. Ванюшин Впервые определил природу метилируемых последовательностей ДНК у разных видов организмов (1959 г.) Обосновал роль метилирования ДНК в регуляции работы гена. Предложил термин «эпимутация» (1987 г.)

26. Репрессия транскрипции посредством метилирования ДНК

27. Взаимосвязь между метилированием цитозина в молекуле ДНК и ацетилированием гистонов

28. Механизмы инактивации гена в результате метилированияпромоторной области • 1. Метильные группы нарушают ДНК-белковые взаимодействия, выступая в большую бороздку ДНК и препятствуя связыванию специфических транскрипционных факторов. • 2. Метилированные районы ДНК специфически связывают транскрипционные репрессоры. • 3. Метилирование ДНК влияет на структуру хроматина.

29. Метилирование ДНК в клетке контролирует все (!) генетические процессы, в том числе такие как : Транскрипция (клеточная дифференцировка) Репликация РекомбинацияРепарация Транспозиция генов Инактивация Х-хромосомы

30. Биологическая специфичность метилирования ДНК: • Видовая (штаммовая) • Тканевая (клеточная) • Органоидная (ядро, митохондрии, пластиды) • Внутримолекулярная (островки метилирования, повторы) • Возрастная • Резкое искажение метилирования ДНК: • отсутствие метильных доноров (рак, гепатома) • суперметилирование ДНК РАК • полное выключение (knockout) ДНК-метилазного гена остановка развития, апоптоз, смерть (без метилирования ДНК жизни нет!)

31. Семейства ДНК-метилтрансфераз (ДНК-метилаз) млекопитающих: DNMT1 – поддержание метилирования В гаметогенезе изоформы: DNMT1o DNMTp DNMT2 – РНК-метилазная активность (может специфично метилировать цитозин в 38 положении антикодоновой петли тРНК аспарагина); связь между метаболическими процессами и репрограммированием метилирования ДНК DNMT3 – метилирование de novo, регуляторные функции при метилировании DNMT3a DNMT3b DNMT3L SAM – донор метильной группы

32. De novo метилирование ДНК и сохранение характера метилирования ДНК • Высокометилированые последовательности: • Сателлитная ДНК • Повторяющиеся элементы (в т.ч. транспозоны и их инертные формы) • Уникальная межгенная ДНК • Экзоны генов

33. Метилирование ДНК метафазных хромосом из мезенхимной стволовой клетки взрослого индивида лимфоцита плода человека 22/24 недель развития Клетки цитотрофобласта хориона легкого печени эмбриона человека 5/6 недель развития N=30 N=49 N=76 N=29 N=32

34. гомологи хромосомы 1 QFH АТ-5-МеС G-сегментация АТ-5-МеС Локализация 5-метилцитозина на хромосоме 1. Оценка интенсивности флуоресценции

35. CpG – островки • неметилированные участки длиной 1 kb • - в 5`-концах 60% промоторов активных генов Что защищает их от метилирования? - они защищены белками - постоянная работа деметилаз - нетипичный состав оснований

36. Деметилирование – удаление метильных групп из ДНК Пассивное деметилирование – реализуется после репликации ДНК, за счет отсутствия метилазной активности. Новосинтезированная нить ДНК не метилируется по образцу старой, и образуется полуметилированная (гемиметилированная) ДНК. Активное деметилирование – задействована ферментативная система, превращающая 5-метилцитозин в цитозин независимо от репликации Долгое время механизм и ферменты, вовлеченные в процесс активного деметилирования ДНК оставались неизвестными!

37. Активное деметилирование ДНК 5-гидроксиметилцитозин – гидроксильная форма 5-метилцитозина может быть промежуточным соединением в процессе активного деметилирования (Tahiliani et al., 2009; Ito et al., 2010). 5-гидроксиметилцитозин описан у млекопитающих в начале 1970-х (Penn et al., 1972). 2009 год: 5-гидроксиметилцитозин выявлен в клетках: мозга почки легкого сердца в эмбриональных стволовых клетках мыши в клетках HeLa в клетках эмбриональной почки (Kriaucionis, Heintz, 2009; Tahiliani et al., 2009).

38. Активное деметилирование ДНК В 2009 году у млекопитающих было идентифицировано семейство белков TET (Ten-Eleven-Translocation), гомологичных белкам трипаносомы JBP1 и JBP2 – оксидазам метильной группы тимина (Tahiliani et al., 2009). Оказалось, что все три белка семейства TET – TET1, TET2 и TET3 – могут превращать 5-метилцитозин в 5-гидроксиметилцитозин (Ito et al., 2010).

39. Деметилирование ДНК с образованием 5-гидроксиметилцитозина

40. Методы анализа метилирования 1.Метилчувствительная ПЦР (Not1, Eag1, SacII, HpaII, HhaI) 2. Метилспецифическая ПЦР Трансформация цитозина в урацил бисульфитом Na 3. MethylLight – метилспецифическая ПЦР в реальном времени 4. Биологические микрочипы 5.Специфические антиметилцитозиновые антитела

42. Волны эпигенетического репрограммирования генома млекопитающих ДНК примордиальных половых клеток значительно метилирована; при миграции клеток в недифференцированные гонады в них наблюдается резкое деметилирование; реметилирование (метилирование de novo) ДНК половых клеток происходит на поздних стадиях созревания. После оплодотворения уровень метилирования остается высоким в импринтированных генах, но резко снижается в неимпринтипрованных отцовских и материнских генах. К стадии бластоцисты уровень метилирования ДНК повышается.

43. Метилирование ДНК и факторы внешней среды Метаболизм SAM – донора метильной группы При дефиците фолиевой кислоты повышен риск возникновения дефектов нервной трубки у плода Причина: снижение уровня метилирования ДНК

44. Метилирование ДНК и факторы внешней среды Доказано влияние на метилирование ДНК металлов – никеля, кадмия, мышьяка, а также хрома, ртути, трихлорэтилена, дихлоруксусной и трихлоруксусной кислоты, бензола, бисфенола. Металлы способствуют образованию в клетке активных форм кислорода, вызывающих повреждения ДНК, которые затрудняют или делают невозможной работу ДНК метилтрансфераз. В 1992 году Баркером была выдвинута гипотеза FEBAD (fetal basis of adult disease). В пользу гипотезы свидетельствует обнаруженная взаимосвязь между воздействием на плод экзогенных и эндогенных факторов и риском последующего развития сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного диабета второго типа, остеопороза и некоторых видов рака.

45. Внешние факторы Внешние факторы, действующие на женщину в период беременности, могут изменять характер метилирования ДНК в ее клетках, модифицировать формирующиеся эпигенетические паттерны плода, а также влиять на процесс репрограммирования в формирующихся половых клетках плода!

46. Метилирование ДНК является обратимой реакцией и в значительной степени подвержено воздействию эндогенных и экзогенных факторов. Эти особенности, с одной стороны, увеличивают риск возникновения ошибок из-за влияния негативных факторов, но с другой – дают возможность проводить коррекцию эпигенетической регуляции генома за счет определенных внешних воздействий, в том числе лекарственных средств, гормонов и диеты.

47. «В последние годы … установлен особый класс заболеваний человека, обусловленный дефектами структуры и модификаций хроматина - так называемые «хроматиновые болезни». С. Назаренко, 2005 г.

48. Синдром Ретта (OMIM 312750) Частота 1 на 10000-15000 детей женского пола Впервые описан Реттом в 1966г (Rett, 1966), повторно в 1983 Хогбергом ( Hagberg, 1993). http://www.mississippichallenge.org/rettsyndrome.html Мутация в гене MeCP2 (MeC binding protein), расположенном на Xq28 http://www.rodim.ru/conference/index.php?s=0b8265fee36f1322b6dab8dae8f038a7&showtopic=83503&pid=4926083&st=765&#entry4926083 • регрессия развития • аутизм • стереотипные движения рук http://swimpig.blogspot.com/2007_02_01_archive.html

49. Синдром ICF (OMIM 242860) (Immunodeficiency, Centromere instability and Facial anomalies syndrome ) Мутации в гене DNMT3B (DNA metiltransferase), расположенном на хромосоме 20q11.2 Luciani et al., 2005 Синдром ICF (иммунодефицит, хромосомная нестабильность, аномалии лицевого черепа) Гетерохроматиновые районы хромосом 1, 9 и 16 неметелированы, вследствие чего растянуты и имеют ветвистую структуру Впервые синдром описан в 1978 году (Hulten, 1978)

50. Синдром Коффина – Лоури (OMIM 303600) Мутация гена RSK (ribosomal S6 kinase), расположенном на Хp21.1-21.2 RSK2 - регулируемая ростовыми факторами серин-треониновая киназа Частота встречаемости 1:40000 - 50 000 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=gene&part=cls&rendertype=figure&id=cls.F1 http://clsf.info/Welcome.htm Впервые был описан 1966 Коффином (Coffin et al., 1966), позже Лоури отметил другие характерные особенности в 1972 году (Lowry et al., 1972).