Mykobakteriológia v 21. storočí

1. Juraj Trenkler, Helena Zajacová ŠN sv. Svorada Zobor, Nitra Národné referenčné centrum pre mykobaktérie Mykobakteriológia v 21. storočí

2. Robert Koch 24. marec 1882

3. Klasické metódy • Mikroskopia – rýchla ale nešpecifická • Kultivácia – vaječné, agarové a tekuté pôdy rast za 21-63 dní • Identifikácia - biochemická z narasteného kmeňa screening do 24 hodín identifikácia týždne až mesiace • Citlivosť - na pôdach 21-40 dní

4. Mikroskopia • Marec 1882 -Koch farbil mykobaktérie zmesou anilínových farbív v alkalickom prostredí. Procedúra trvala 20-24 hodín. • Máj 1882 - Ehrlich - zlepšená metódu, ktorá bola tiež založená na alkalickom roztoku. • August 1882 - Ziehl popísal novú metódu farbenia, v ktorej použil namiesto alkalického, kyslé prostredie, v r.1892 Neelsen popísal metódu, ktorú používame dodnes • 1962 - Truant, Brett a Thomas- fluorescenčnéfarbenie

5. Mikroskopia

6. Kultivácia • Koch – morča, králik, koagulované sérum • 1931 - Löwenstein, 1932 Jensen • 1947 - Dubos a Middlebrook (1947) pôda 7H9 • 1977 - Middlebrook, Reggiardo, Tigertt-7H12BACTEC 460TB • 1980 – MGIT – použítá neskôr v BACTEC 960

7. Mycobacteria Growth Indicator TubeMGIT

8. Testy citlivosti • CANETTI G, et alt.: MYCOBACTERIA: LABORATORY METHODS FOR TESTING DRUG SENSITIVITY AND RESISTANCE. Bull World Health Organ. 1963;29:565-78. • Proporčná metóda na LJ pôde alebo agarových pôdach – 21-28 dní • Rýchlejšie metódy na metabolických pôdach – 7-13 dní • Mikroskopická metóda v tekutej pôde – 7 dní

9. Genetické metódy - predpoklady • 1953 – Wilkins, Watson, Crick – objav štruktúry DNA – Nobelova cena 1962 • 1968 – Khorana, Holley, Nirenberg – Nobelova cena za popis translacie NK do bielkovín • 1975 – Sanger sekvenovanie DNA – Nobelova cena 1980 • 1983 – Kary Mullis – vynález PCR – Nobelova cena 1993 • 1998 – Popis sekvencie DNA M.tuberculosis H37Rv

10. Použitie genetických metód v mykobakteriológiiDlhý generačný čas mykobaktérií • Dôkaz mykobaktérií vo vzorke • Identifikácia • Epidemiologická analýza • Hľadanie markerov rezistencie

11. Dôkaz mykobaktérií vo vzorke • Accuprobe • COBAS Amplicor Roche • INNO-Lipa Mycobacteria • HAIN Genotype • „Home made“ PCR – IS6110, HSP65.......problémom je senzitivita a inhibíciaprednosťou je rýchlosť a špecificitadokazuje iba DNA

12. Identifikácia • Dôkaz špecifickej DNA pre daný druh • Komplex M.tuberculosis – PCR na IS 6110potvrdí príslušnosť ku komplexu MTBC • Netuberkulózne mykobaktérie- analýza génomu ako 16srDNA, HSP65 sondami, metódou PRA alebo sekvenovaním

13. Hľadanie markerov rezistencie • U niektorých AT poznáme presne alebo čiastočne miesta na DNA, kde mutácia znamená rezistenciu • Ide hlavne o RIF a INH • Možnosť stanovenia rezistencie aj priamo z materiálu pri mikroskopickej pozitivite • Stanovenie citlivosti na RIF čo najskôr je najdôležitejšia informácia pre liečbu

14. Polymerázová reťazcová reakcia

15. Hybridizácia

16. Sekvenovanie DNA

17. Evolúcia M.tuberculosis

18. Mykobaktérie I.

19. Mykobaktérie II.

20. Mykobaktérie III.

21. Epidemiologická analýza M.tuberculosis • Sledovanie šírenia konkrétneho kmeňa v populácii • Analýza opakovaných ochorení – nová infekcia, relaps • Odhaľovanie laboratórnych chýb • Tri najčastejšie metódy: • RFLP – Analýza fragmentov po pôsobení restrikčných endonukleáz • MIRU – Analýza vnorených sekvencií • Spoligotyping – Analýza opakujúcich sa sekvencií

22. Epidemické markery M.tuberculosis

23. Genetické metódy v ŠN sv. Svorada-Zobor • Dôkaz M.tuberculosis – COBAS Amplicor • Identifikácia v rámci komplexu MTBC – genetické sondy a „home made“ PCR na RD • Identifikácia mykobaktérií – genetické sondy a metóda PRA • Markery rezistencie – genetické sondy (RIF, INH) a „home made“ PCR • Epidemiológia M.tuberculosis – odskúšané MIRU – vprípade financovania je možné začať okamžite robiť