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第十一章 基因工程. 本章重点. 基因工程的概念和一般操作流程。. 基因工程工具酶、载体、目的基因获得方法、重组连接技术、导入技术、以及重组的筛选等。. 动物克隆技术与转基因技术. 11.1基因工程概述. 基因工程 （ genetic engineering）， 也叫基因操作、遗传工程，或重组体 DNA 技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“ 克隆 ”）和行使正常功能（称之为“ 表达 ”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。. 基因工程概述. 基因工程的基本流程.
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本章重点 基因工程的概念和一般操作流程。 基因工程工具酶、载体、目的基因获得方法、重组连接技术、导入技术、以及重组的筛选等。 动物克隆技术与转基因技术
11.1基因工程概述 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中，并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和行使正常功能（称之为“表达”），从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。
基因工程概述 基因工程的基本流程 目的基因获得 重组DNA分子构建 导入受体细胞 转化体细胞扩增、鉴定与筛选
11.2 工具酶 11.2.1限制性内切酶 识别双链DNA中特定序列并切割双链DNA的核酸内切酶。 Ⅰ型和Ⅲ型限制酶的切点不固定，不能产生可以利用的DNA片段，只有Ⅱ型限制酶具有可以控制和预测的位点特异性切割的性质，并且产生固定的DNA片段，因此基因工程中所用的限制酶都是Ⅱ型限制酶。
限制性内切酶1 II限制性内切酶基本特征 特异性位点切割双链DNA 识别序列为4-6个碱基，大多双重交替对称 切割产生平头末端(blunt end/flush end)和粘性末端(cohesive)
限制性内切酶2 EcoR l识别6个核苷酸序列，在特定的G-A之间切割DNA分子：
限制性内切酶3 BamHⅠ识别6个核苷酸的序列，在特定的A-A之间切割DNA分子
限制性内切酶4 有少数限制的酶在双链DNA的对称轴处切割，产生平齐末端（平端），如BalⅠ和SmaⅠ
限制性内切酶用途 产生特异的限制酶片段； 建立DNA分子的限制酶图谱； 构建基因文库 用限制酶切出的相同的粘性末端，以便重组
11.2.2. DNA聚合酶 DNA聚合酶种类 ①大肠杆菌聚合酶Ⅰ（全酶） ②大肠杆菌聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段） ③T4噬菌体DNA聚合酶 ④T7噬菌体聚合酶及经修饰的T7噬菌体聚合酶（测序酶）
DNA聚合酶种类 ⑤耐热DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶） ⑥末端转移酶 ⑦逆转录酶
DNA聚合酶用途 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶） ①用切口平移方法标记DNA（可作杂交探针） ②利用其5->3’外切核酸酶活性降解寡核着酸作为合成cDNA第二链的引物 ③用于对DNA分子的3’突出尾进行末端标记，用于DNA序列分析
用途 Klenow片段 ①补平限制性内切酶切割DNA产生的3’凹端； ②用[32P]补平3’凹端，对DNA片段进行末端标记； ③对带3’突出端的DNA进行末端标记； ④在cDNA克隆中，用于合成cDNA第二链； ⑤在体外诱变中，用于从单链模板合成双链DNA； ⑥应用双脱氧链末端终止法进行DNA测序
用途 T4噬菌体DNA聚合酶 ①补平或标记限制性内切酶消化DNA后产生的3’凹端 ②对带有3’突出端的DNA分子进行末端标记 ③标记用作探针的DNA片段 ④将双链DNA的末端转化成为平端 ⑤使结合于单链DNA模板上的诱变寡核着酸引物得到延伸
用途 T7噬菌体DNA聚合酶及由此改造的测序酶 ①用于拷贝长段模板的引物延伸反应 ②通过补平或交换（置换）反应进行快速末端标记
用途 耐热 DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶） ①用于DNA测序 ②用于聚合酶链式反应（PCR）对DNA片段进行体外扩增
用途 末端转移酶 ①给载体或CDNA加上互补的同聚尾 ②用于DNA片段3’末端的放射同位素标记
11.2.3 DNA连接酶 T4 DNA连接酶 ①连接带匹配粘端的DNA分子 ②双链DNA分子互相连接或合成的接头相连接
11.2.4 核酸酶 S1核酸酶 ①去除DNA片段的单链突出端，使之成为平端 ②去除cDNA合成时形成的发夹结构 ③施行Sl核酸酶保护试验（Sl protection或Sl mapping），分析转录产物 ④成熟mRNA与基因组DNA杂交后，结合Sl核酸酶水解，可确定内含子在基因组DNA中的定位 ⑤修整渐进性删除突变的末端
核酸酶 Bal 31核酸酶 ①用于不同长度的删除突变克隆实验及基因结构、机能分析 ②绘制DNA限性内切图谱 ③研究超螺旋DNA的二级结构和致畸剂引起的双链DNA螺旋结构变化
11.3 基因工程载体 载体（vector）是把外源基因引入受体细胞并在其中能自我复制的小DNA 分子。 基因工程中的载体应具有如下一些特性： 独立和稳定的 DNA自我复制 易于从宿主细胞中分离，并进行纯化 具有适当的限制性内切酶位点 有报告基因
11.3.1 细菌质粒载体 质粒是细菌染色体外的小型环状双链的DNA分子。 质粒DNA的分子特性 质粒DNA分子呈双链共价封闭环状、自然旋转成超螺旋构型（closed circle DNA， ccDNA），有时会因单链断裂而成为开链环状DNA（open circle DNA， ocDNA）有时双链断开成线性DNA（liner DNA， lDNA）
11.3.2 噬菌体载体 细菌质粒载体所能携带的外源基因只限于10kb以下的DNA片段，噬菌体作为载体，可插入长10kb～20kb甚至更大的一些外源DNA片段。 λ噬菌体 λ噬菌体是一种温和噬菌体，即在感染其宿主菌大肠杆菌后，呈现溶菌性和溶源性两类生长方式。
11.3.3 粘性质粒载体 粘性质粒载体（也称柯斯质粒载体或粘粒，cosmid vector）本质上是含有抗性基因、单一克隆位点以及λDNAcos位点（体外包装所必需）的细菌质粒。 粘性质粒优点是克隆容量较大，可容纳35kb－45kb外源DNA，转化率也较高。常用的粘性粒有PHC79。PJB8、MUA－3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内。切酶的单一酶切位点。极其适合高等真核基因的克隆工作。
11.3.4 YAC载体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,）是人工构建的染色体： 目前能插入片段最大的载体。
11.3.5 病毒载体 细菌质粒和噬菌体具有严格的宿主选择性，只能在相应的细菌中生存和繁殖，从而限制了基因工程的广泛性。 动物病毒载体是一种比较理想的真核基因工程载体，在其序列中往往具有几个很强的启动子，它可使排列在其后方的核酸序列高产量和高频率地复制和表达。
SV40 病毒的基因组是共价封闭环状双链DNA，长5．2kb。基因组在功能上分为早、晚期转录两个区域。 pCAT－basic plasmid在SV40的调节片段上游插入一个氯霉素乙酸基转移酶（chloramphenicol acetylfransferase， CAT）
11.4获取目的基因的方法 11.4.1鸟枪法 在基因组DNA文库中筛选出目的基因 鸟枪克隆法在基因组DNA文库中筛选到的目的基因，与染色体中的天然基因是一样的，含有内含子，在结构基因两端的连接区还有转录调控序列片段，即调节基因。这样的基因可供基因表达的调控分析。因为有内含子的存在，这样获得的结构基因不宜在原核宿主组织中表达。
11.4.2化学合成基因 将核着酸或寡核苷酸片段，一个一个地或一片段一片段地缩合起来，成为一个一个基因的核苷酸片段 。
11.4.3聚合酶链式反应 polymerase chain reaction， PCR优点很多，具有快速、灵敏、简便，特异等特点。PCR对DNA模板的质量和数量要求比其他实验方法低得多 但PCR也有缺点：扩增DNA的长度一般不超过 2kb， Taq DNA聚合酶在合成作用时也会发生错误，出错率0．25％，费用比较昂贵。
11.5 DNA体外重组与基因转移 11.5.1体外重组 将目的基因与载体连接在一起，即DNA的体外重组。 粘性末端连接 ①同一限制酶切位点连接 ②不同限制酶切位点连接这两种方法
体外重组条件与过程 ①酶切割产生单链突出的粘性末端（cohensive terminal） ②酶切位点附近的DNA序列不影响连接 两个DNA片段一起退火（anneal）时，粘性末端单链间进行碱基配对，然后在T4 DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子
平端连接 具有平末端的酶切载体只能与平末端的目的基因连接。T4 DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接 有时载体DNA片段是平末端，而目的基因却是粘性末端，那就需要进行处理，使载体DNA和目的基因的末端一致起来，通常是将目的基因的粘性末端修饰成平末端，即添补法和削除法。
同聚物加尾连接 同聚物加尾连接是利用同聚物序列之间的退火作用完成的连接
11.5.2 基因转移 ①转化(transformation)，是将重组质粒导入受体细菌细胞 ②转染(transfection)，是将携带外源基因的病毒感染受体细胞 ③微注射技术(microinjection) ④电转化法(electro-transformation) ⑤微弹技术(micro neblast technique也叫高速粒子轰击法micro projector或基因枪技术gene blaster technique) ⑥脂质体介导法(liposome mediated gene trans-fer)；
11.7 转基因技术 转基因动物是指以实验方法导入外源基因，在染色体组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物。 融合法，包括细胞融合，微细胞介导融合等 化学法，包括DNA-磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法、染色体介导法等 物理法，包括显微注射法、电脉冲法、细胞冻存法等 病毒感染法，包括重组DNA病毒感染、重组RNA病毒感染等
11.8 克隆技术 生产哺乳动物克隆的方法主要有胚胎分割和细胞核移植两种，目前应用的主要是后者。 （1）培育优良畜种和生产实验动物； （2）生产转基因动物 （3）用于细胞和组织替代疗法； （4）复制濒危的动物物种
11.9基因诊断 用分子生物学方法检测患者体内遗传物质的水平或结构变化而作出的或辅助临床诊断的技术，称为基因诊断 核酸杂交 聚合酶链反应 限制性内切酶酶谱分析 RFLP
