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免疫检测

免疫检测. 爱博泰克. 常用免疫检测方法. IHC( 免疫组化 Immunohistochemistry) 是融合了免疫学原理 ( 抗原抗体特异性结合 ) 和组织学技术 ( 组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等 ) ，通过化学反应使标记 抗体 的显色剂 ( 荧光素、酶、金属离子、同位素 ) 显色，来对组织 ( 细胞 ) 内抗原进行定位、定性及定量的研究 ( 主要是定位 ) 。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。.

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Presentation Transcript

  1. 免疫检测 爱博泰克

  2. www.themegallery.com 常用免疫检测方法

  3. www.themegallery.com IHC(免疫组化Immunohistochemistry) 是融合了免疫学原理(抗原抗体特异性结合)和组织学技术(组织的取材、固定、包埋、切片、脱蜡、水化等)，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素)显色，来对组织(细胞)内抗原进行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。样本是细胞或组织，要在显微镜下观察结果，可能出现膜阳性、质阳性和核阳性。

  4. www.themegallery.com ELISA(酶联免疫吸附试验Enzyme linked immunosorbent assay) 用到了免疫学原理和化学反应显色，待测的样品多是血清、血浆、尿液、细胞或组织培养上清液，操作上 开始需要将抗原或抗体结合到固相载体表面，从而使后来形成的抗原-抗体-酶-底物复合物粘附在载体上，这就是“吸附”的含义。

  5. www.themegallery.com WB (蛋白质印迹Western Blot) 先进行SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原-抗体-标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。

  6. 3 3 原理 1 3 步骤 2 其他 www.themegallery.com Western Blot

  7. www.themegallery.com 原理 • 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 • 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变（这个过程就是转膜）。 • 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶标记的第二抗体起反应，经过底物显色以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

  8. s P s P s P P s Product s s P s s s E Secondary Antibody/Enzyme (E) Primary Antibody E Protein Protein Blocking Agent Blocking Agent Blocking Agent Membrane www.themegallery.com

  9. 样品处理 凝胶电泳 结果分析 样品印迹 免疫检测 www.themegallery.com 步骤

  10. www.themegallery.com 样品制备 组织、细胞、裂解液、蛋白酶抑制剂、 Loading Buffer 一般比例：新鲜组织1:10~20裂解液，细胞107-1ml裂解液，制备高浓度样品可酌情减少裂解液 裂解液成分：ph7.2~7.5的tris-hcl缓冲体系，有效裂解成分多为去污剂NP-40, Triton X-100，去氧胆酸钠 蛋白酶抑制剂：PMSF,COCKTAIL Loading Buffer：甘油，sds，还原剂（DTT或2-巯基乙醇）

  11. www.themegallery.com 样品制备 • 上样缓冲液处理蛋白质样品 • SDS： • 阴离子去污剂 变性剂 • 氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束。 • 蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，消除了不 同分子之间原有的电荷差异。 • 与强还原剂(巯基乙醇）一起使蛋白分子氢键、疏水键打开，使蛋白质分子线性化。

  12. www.themegallery.com • PAGE：聚丙烯酰胺凝胶 四甲基乙二胺（TEMED) 丙烯酰胺 N,N-亚甲基双丙烯酰胺 过硫酸铵（AP) 分离胶 分离胶母液 10%AP TEMED 激活作用 聚丙烯酰胺 共聚合 浓缩胶 浓缩胶母液 10%AP TEMED 提供自由基

  13. www.themegallery.com

  14. www.themegallery.com 灌制分离胶 加入异丙醇 灌制浓缩胶

  15. Staking gel Separating gel www.themegallery.com • 上样与电泳

  16. www.themegallery.com 样品印迹 • 转膜：要将电泳后分离的蛋白质从凝胶中转移到固相载体（例如NC膜）上。 蛋白质带负电荷，凝胶在负极一侧，硝酸纤维素膜在正极一侧，接通电源以后，蛋白质由负极向正极转移至膜上。

  17. www.themegallery.com 免疫检测 封闭 曝光 一抗、二抗孵育 二抗与底物反应显色

  18. www.themegallery.com 免疫检测 • 封闭： 为避免NC与作为检测试剂的特异性第一抗体发生非特异性结合，使非特异性背景提高，需对NC上的潜在结合位点进行封闭处理。 5%脱脂奶粉（脱脂奶粉+PBST) Tween-20的作用：减少非特异性吸附，不影响抗体与抗原的结合。

  19. www.themegallery.com 免疫检测 一抗、二抗孵育： • 把NC膜放在培养皿中，加入一抗溶液，摇床上平缓摇动，于室温孵育1小时。 • 倒掉一抗溶液，用PBST漂洗膜4次，每次5min。 • 加入用PBST配制的二抗，摇床上缓慢摇动，于室温孵育半小时。 • 倒掉二抗溶液，用PBST漂洗膜4次，每次5min。

  20. www.themegallery.com 免疫检测 • 二抗与底物反应显色（ECL显色） • 分类 1、放射自显影 2、底物化学发光ECL 3、底物荧光ECF 4、底物DAB显色 • 发光液A和B分别是鲁米诺和过氧化氢，在辣根过氧化物酶（HRP）的催化作用下,鲁米诺与过氧化氢反应生成一种过氧化物，过氧化物不稳定随即分解，形成一种能发光的电子激发中间体,当后者由激发态返回至基态，在暗室内形成肉眼可见的化学光带，利用胶片感光原理，将结果记录下来。

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