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分离纯化方法 2 ----- 电泳技术（上）

分离纯化方法 2 ----- 电泳技术（上）. Electrophoresis. Electrophoresis 第一节　电泳概述 第二节　核酸电泳 第三节　蛋白质电泳. 第一节 电泳概述. 电泳是指荷电的胶体颗粒在电场中的移动。 —— Arne Tiselius(1959), Electrophoresis Theory, Methods and Applications . 一、 电泳的发展 二、 电泳的定义及常用术语 三、 电泳技术的基本原理 四、 电泳技术的种类 五、 电泳的支持介质 六、 电泳系统. 一、电泳技术的发展.

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分离纯化方法 2 ----- 电泳技术（上）

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  1. 分离纯化方法2-----电泳技术（上） Electrophoresis

  2. Electrophoresis第一节　电泳概述第二节　核酸电泳第三节　蛋白质电泳Electrophoresis第一节　电泳概述第二节　核酸电泳第三节　蛋白质电泳

  3. 第一节 电泳概述 电泳是指荷电的胶体颗粒在电场中的移动。 ——Arne Tiselius(1959), Electrophoresis Theory, Methods and Applications. 一、电泳的发展 二、电泳的定义及常用术语 三、电泳技术的基本原理 四、电泳技术的种类 五、电泳的支持介质 六、电泳系统

  4. 一、电泳技术的发展 • 1809年，俄国物理学家Reŭss进行了世界上第一次电泳实验。 • 1937年，Tiselius制成移动界面电泳装置，将血清分离成血清蛋白和球蛋白。 • Tiselius A设计出世界上第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳”分离模式。他用光学方法观察到在电泳迁移过程中血清蛋白质界面的移动，首先证明了血清是由白蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白组成的，为表彰他对电泳技术所做出的突出贡献，1948年他被授予诺贝尔奖。

  5. 1940年左右：以纸为支持物的电泳问世。 • 60年代以后：发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。 • 1967年，Shapiro 发明SDS电泳。 • 1969年，Weber应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术测定了蛋白质的分子量 。 • 1970年，Laemmli发明不连续SDS电泳。

  6. 70年代以后推出了多种电泳模式： • 圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术 • 1975年，O’Farrell 发明了ISO-DALT双向电泳技术。 • 1985年，Gorg 发明了IPG-DALT双向电泳技术。 • 90年代推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。

  7. 二、电泳的定义及常用术语 1、电泳(electrophoresis，简称EP) 带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移的现象。 • 移动的速度与颗粒带电的强弱、分离介质的阻力、电极液的粘度和电场强度等因素有关。 • 生物大分子在电场中移动的速度除上述因素外还与分子形状、相对分子质量大小、分子的带电性质等因素有关。

  8. 2、电泳迁移(electrophoretic migration)：EM，单位是cm 在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动。 3、迁移时间(migration time)：用t表示，单位是min 在电泳过程中，带电粒子在电场的作用下做定向移动所用的时间。 4、电泳速度(electrophoretic velocity)：用V表示 在单位时间内，带电粒子在电场的作用下做定向运动的距离，单位是cm /min。 5、电场强度(electric field strength)：用E表示 在给定的电泳支持物两端电极施加电压后所形成的电效应，单位是 V/cm。 E = V /L 式中V为电压，L为两端电极的距离。

  9. A B 6、电渗(electroosmosis)现象 • 指靠近固相支持物的溶液层的泳动现象。 • 固相支持物表面存在荷负电的离子基团； • 电泳溶液中荷正电离子在支持物表面形成一个正离子层； • 正离子层溶液在电渗力作用下朝负极方向移动，如图A。 • 若固相支持物表面离子带负电荷，则电渗流朝正极移动，如图B。

  10. 7、相对迁移率(relative mobility)：用mR 表示样品的迁移距离与示踪染料的迁移距离之比即为相对迁移率，即 样品的迁移距离(cm) mR = ————————————— 示踪染料的迁移距离(cm)

  11. 三、电泳技术的基本原理 • 在一定pH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 + -

  12. EQ V= 6πrη Ａ、电泳的基本原理 若将带净电荷Q的粒子放入电场，则该粒子所受到的电荷引力为： F引=E Q （1） 在溶液中,运动粒子与溶液之间存在阻力F阻 F阻=6πrηV 当F引=F阻时 EQ= 6πrηV 由上式可以看出,粒子的移动速度(泳动速度V)与电场强度(E) 和粒子所带电荷量(Q)成正比,而与粒子的半径(r)及溶液的粘度 (η)成反比。非球形分子（如线状DNA）在电泳过程中受到更大 的阻力，即粒子的泳动速度与粒子形状有关。 （2） （3） （4）

  13. EQ V= 6πrη 迁移率 m 由（4）可知，带电粒子的泳动速度受电场强度影响，使得同一种带电粒子在不同电场里泳动速度不同，为了便于比较，常用迁移率 m（或称泳动度，指带电粒子在单位电场强度下的泳动速度）代替泳动速度表示粒子的泳动情况。 m = V/E = Q/6πrη （5） 由上式可以看出，迁移率仅与球形粒子所带电荷数 量，粒子大小及溶液粘度有关而与电场强度无关。 （4）

  14. 有效迁移率U 由于蛋白质、氨基酸等的电离度α随溶液pH变化而不同，所以实际上常使用有效迁移率。有效迁移率U为迁移率m和当时条件下电离度α的乘积。 U = m α （6） 将（6）式代入（5）式得： U =（7） Q α . 6πrη . 由（7）式可以看出，凡能影响溶液粘度η的因素如温度，影响分子带电量Q及解离度α的因素如pH的改变，都会对有效迁移率，产生影响。

  15. EQ V= 6πrη Ｂ、带电颗粒移动的影响因素 η：介质黏度；r：分子半径；υ：分子移动速度; E：电场强度； q ：颗粒净电荷 • 1、颗粒性质 形状：越接近球形， υ↑ 大小： 直径越小， υ↑ 净电荷：净电荷越大， υ↑

  16. EQ V= 6πrη 带电颗粒移动的影响因素 2．电场强度：E ↑则 υ ↑。 • 根据电场强度分类： (1)常压电泳：E=2-10v/cm (2)高压电泳： E=70～200V／cm 。

  17. EQ V= 6πrη 带电颗粒移动的影响因素 3．溶液性质 • pH：决定带电颗粒的解离程度和所带净电荷的量。为使电泳时pH值恒定，必须采用缓冲液作为电极液。 • 溶液的离子强度：0.02～O.2之间。缓冲液离子强度过高，则颗粒的电动电势越小，泳动度也越小。 • 粘度：粘度大，则 υ↓

  18. 带电颗粒移动的影响因素 4．电渗：促进或阻碍泳动

  19. 带电颗粒移动的影响因素 5．焦耳热：Q=I2RT 焦耳热大：分辨率下降，温度过高会使样品中的生物大分子变性失活，融化或烧断支持介质。 6．筛孔 筛孔大则泳动速度快。

  20. 四、电泳技术的种类 按原理分 1、显微电泳 指利用显微镜直接观察大颗粒物质电泳行为的过程。 2、自由界面电泳 又称移动界面电泳，是指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。其装置复杂，价格昂贵，费时费力，不便于推广应用。指胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在胶体溶液和溶剂之间形成界面的电泳过程。该电泳不受支持物的影响，分离效果较好，但需要一套复杂的电泳装置。 3、区带电泳 是指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用主要是防止电泳过程中的对流和扩散，以使被分离的成分得到最大分辨率的分离。区带电泳由于采用的介质不同以及技术上的差异，又可分为不同的类型。 样品物质在惰性支持物上进行电泳的过程。不同的离子成分在均一的缓冲液系统中分离成独立的区带。

  21. 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。 ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，其优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 • 以上二种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 ③淀粉凝胶电泳：多用于同工酶分析，凝胶铺厚些，可一层一层剥层分析（一板多测）。天然淀粉经加工处理即可使用，但孔径度可调性差，并且由于其批号之间的质量相差很大，很难得到重复的电泳结果，加之电泳时间长，操作麻烦，分辨率低，实验室中已很少使用。 ④琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 ⑤聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。

  22. 聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质

  23. 五、电泳的支持介质 1、支持介质的作用：防止在电泳过程中分子的对流和扩散，使被分离物质得到更有效的分离。 2、支持介质的特性： (1)物理性质稳定：在电泳过程中不受环境因素的影响，保持原有的状态和性能。 (2)化学惰性：在电泳过程中不与缓冲系统中的各种离子和待分离的生物大分子发生化学反应，不干扰生物大分子的电泳过程。 (3)分布均匀：内电渗小，结果重复性好

  24. 3、支持介质的种类 • 电泳的固体支持介质可以分为两类: • (1)薄膜类：纸类，醋酸纤维素薄膜，聚酰胺薄膜等. • 这类支持介质化学惰性好，在电泳过程中产生的对流和扩散较小，分离的基本原理主要是基于生物大分子的电荷密度。 • (2)凝胶类：淀粉凝胶，琼脂糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶等。 • 能防止对流，减小扩散 • 分子筛效应(molecular sieving effect)

  25. 六、电泳系统 1、电泳仪： 根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类： (1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳； (2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序； (3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。

  26. 电极 电极 U形管 2、电泳槽 （1）自由界面电泳槽——自由界面电泳 Tiselius自由界面电泳装置示意图

  27. （2）圆盘电泳槽—— 管状电泳或圆盘电泳(disc electrophoresis) 圆盘电泳槽

  28. 垂板电泳槽 转移电泳槽 平板电泳槽 双向电泳槽 （3）板状电泳槽——板状电泳(slab electrophoresis)

  29. 3、附属设备 梯度混合仪 外循环恒温系统 脱色仪 凝胶干燥系统 凝胶扫描仪 凝胶成像仪等。

  30. 第二节 琼脂糖凝胶电泳

  31. 一、琼脂糖凝胶的结构、特点与应用 1、结构 • 琼脂糖是由D-半乳糖和3，6脱水的L-半乳糖交替连接构成的多糖链。 • 琼脂糖在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时，它们之间以氢键方式相互连接就成了线性的双链单环状的琼脂糖，经凝聚即呈束状的琼脂糖凝胶。

  32. 2、琼脂糖凝胶的特点 • 具有较大微孔，对样品吸附极微。 • 透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测及定量测定。 • 染色、脱色程序简单，背景色低，便于定量测定。 • 容易干成薄膜，便于长期保存。 • 无毒性。 • 是高灵敏度放射自显影的理想材料。

  33. 3、应用 • 作为电泳支持物，分离蛋白质和同工酶。 • 将琼脂糖电泳与免疫化学相结合，发展成免疫电泳技术。 • 琼脂糖凝胶电泳也常用于分离、鉴定核酸，如DNA鉴定，DNA限制性内切核酸酶图谱制作等。

  34. 二、DNA的琼脂糖凝胶电泳 • 琼脂糖凝胶：用于分离大于200bp的DNA片段; 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 • 聚丙烯酰胺凝胶：用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开，能容纳相对大量的DNA。 用于核苷酸多态性的分析。

  35. 1、琼脂糖电泳分离DNA时影响迁移率的因素 （1）核酸分子大小 在凝胶中，DNA片段迁移距离(迁移率)与碱基对的对数成反比。但是当DNA分子大小超过20kb时，普通琼脂糖凝胶就很难将它们分开。

  36. （2）琼脂糖的浓度 不同大小的DNA需要用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

  37. （3）核酸构型 • 不同构型DNA的移动速度次序为： 共价闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA。 • 当琼脂糖浓度太高时，环状DNA(一般为球形)不能进入胶中，相对迁移率为O(Rm=O)，而同等大小的直线双链DNA(刚性棒状)则可以长轴方向前进(Rm>O)。

  38. （4）电源电压 （5）嵌入染料的存在 （6） 离子强度影响

  39. 2、凝胶类型： 垂直型和水平型(平板型) 3、电泳缓冲系统： TAE ：贮存液为50× TBE： 贮存液为5× TPE： 贮存液为10×

  40. TAE：由Tris、乙酸和EDTA钠盐组成 优点： • 超螺旋在TAE中电泳时更符合实际相对分子质量。 • 双链线状DNA在TAE中迁移速率较其他两种缓冲液快约10％。 • 电泳大于13 kb 的DNA片段时用TAE缓冲液分离效果更好。 • 回收DNA片段时宜用TAE缓冲系统进行电泳。 缺点： • 缓冲容量小。

  41. TBE：由Tris、硼酸与EDTA钠盐组成 优点： • 缓冲能力强，长时间电泳时首选用TBE • 当用于电泳小于1 kb的片段时分离效果更好。 缺点： • 易造成高电渗作用 • DNA片段的回收效率降低，所以不宜在回收电泳中使用。

  42. TPE：由Tris、磷酸与EDTA钠盐组成 • 优点： • 缓冲能力也较强 缺点： • 由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。

  43. 4、上样缓冲液 常用6×缓冲液配方： • O.25％溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-40%蔗糖水溶液（4℃） • O.25％溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-15%（m/V)聚蔗糖400水溶液（室温）。 • O.25％溴酚蓝-0.25%二甲苯青FF-30%甘油水溶液（ 4℃ ，不适用于TBE）

  44. 5、核酸的染色与检测 • 溴化乙锭(ethidium bromide，EB)： • 是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。 • 银染 • 银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。其灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA回收复杂。

  45. X-ray structure of a complex of ethidium with 5-iodo-UpA

  46. 6、应用 （1）核酸的分离、检测和制备 （2）测定核酸的分子量 分离线性DNA时，迁移率与分子量相关，而与结构和碱基组成无关。

  47. 7、基本操作程序 （1）琼脂糖凝胶的制备 （2）点样 （3）电泳 （4）显色 （5）观察及照像

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