Protein ubiquitination

1. Proteinubiquitination Proteinubiquitination: regulatoryprocessinfluencingseveralaspectofeukaryoyiccellbiology Polyubiquitin (polyUb) chain: link ε-amino groupof a LysofoneUbto the C-terminalcarboxylgroupof the nextUb in the chain E1-E2-E3 responsibleforactivating and transferringUbtoproteins FundamentalmechanismsofUb-chainassembly and of E1-E2-E3 regulationstillnotclearlyunderstood • Passmore, and Bardford, Biochem J, 2004 • Pickart, Cell, 2004 • Brzovic and Klevit, Cell Cycle, 2006 • Hochstrasser, Cell, 2006

2. Ubiquitinlikeproteins(Ubls) 8-20 kDa Ub 76 aa Globular domain (4βstrands in a antiparallelβsheet +αhelix) + flexibleC-terminalterminatingwith a gly 7 Conservedlysineresidues in Ub N.B. ISG15: ha due domini Ubl Di-Ubiquitina Ogni Ubl ha il suo set di E1-E2-E3

3. E2: Ub-conjugatingenzymes Cysforms a thiolester bond toC-terminalGlyofUb Asnstabilizesoxyaniontransition state E1 E3/E3 Multi-domain E2 classification in 17 familesreflectingstructuralorganizationof cat. dom. IdentificationofphosphorylationsbyCdks and CK2 kinasesaffecting E2 activity • Michelle et al., J Mol Evol, (2009) • Ye and Rape, Nat Rev Mol Cel Biol (2009)

4. B_Cterm K48-linked polyUb Diverse strutture sperimentali di Di-Ubcrosslinkata K48 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUbcrosslinkata via K48 B_VAL70 B_LEU8 A_ILE44 B_ILE44 A_LEU8 A_VAL70 Legame isopeptidico polyUb crossilinkata by K48 sono segnale universale per la degradazione da proteasoma Adottano una CONFORMAZIONE CHIUSA in cui L8, I44 and V70 (patch idrofobico sulla superficie di una singola molecola di Ub) sono sequestrati all’interfaccia tra due molecole di Ub adiacenti

5. Tetra-Ubiquitinacrosslinkata K48 Strutture cmq dinamiche in soluzione – alcuni di questi residui potrebbero diventare accessibili per diretta interazione con fattori di riconoscimento For example, does linkagespecific recognition arise from differential display of the events, ubiquitin (Ub) is engaged as a signaling molehydrophobic surfaces or from the presence of novel cule in the form of different polyubiquitin (polyUb) linkage-specificsurfaces? chains. PolyUb chains are formed by making isopep- hHR23a (human homolog of yeast Rad23a

6. K63-linked polyUb Diverse strutture sperimentali di Di-Ubcrosslinkata K63 via NMR o X-ray e una struttura X-ray della tetra-polyUbcrosslinkata via K63 polyUbcrosslinkata via K63 agisce come segnale regolatorio piuttosto che degradativo in molti pathway, Adotta conformazione estesa in soluzione senza contatti diretti tra patch idrofobici

7. MonomericUb K48 Hydrophobic patch G76 K63

8. IL RICONOSCIMENTO SPECIFICO DI UNA DELLE DUE CATENE HA ORIGINE DA UN DIVERSO MODO DI ESPRRE LE SUPERFICI IDROFOBICHE O DALLA PRESENZA DI NUOVI PATCH DI INTERAZIONE SULLA SUP. DELLE DUE CATENE? Come conseguenza a queste differente in conformazione, il segnale di riconoscimento presentato dalle due tipologie di catene è molto diverso . Differenti modalità di interazione con gli UBA-2 domain (di hHR23a). UBA-domain sono domini di legame per Ub – L’UBA domain di hHR23a è coinvolto nella modulazione dell’interazione tra catene di poliUb e proteasoma (alta affinità per catene poliUb linkate via K48) Varadan R et al. 2005, Mol Cell, 18, 687-698

9. Non-canonicalPoliUbchains Nessuna di esse isolata finora in studi in vitro K48 Hydrophobic patch G76 \ K63 K6 K27 K11 K29 • Lo studio delle catene non canoniche importante per: • Chiarire i meccanismi molecolari con cui avviene riconoscimento di specifiche catene di poliUb • Capire se solo le catene linkate da K48 o anche altre permettono una struttura globulare stabilizzata da interazioni non covalenti tra molecole di Ub adiacenti • La conformazione estesa di catene linkate via K63 come hp da Varadanet al. è dovuta a vincoli sterici che prevengono diretto contatto tra i patch idrofobici di due unità di Ub K33