연세대학교 조현수

1. 연세대학교 조현수

2. Crystal : • a three-dimensional periodic arrangement of molecules. • Often, the lowest free energy state. • Packing molecules in a regular way. • Q1). Protein crystal structure는 생체 속의 구조를 나타내는 것인가 ? • 결정조건과 생체 속 환경이 달라서 구조도 다를 것이다. • A1)첫째는 현재까지 밝혀진 동일한 단백질의 NMR구조와 crystal 구조가 같거나 아주 비슷하였다. • 둘째는 enzyme crystal의 경우 실재 반응이 일어나고 활성을 가지고 있다.

3. X선 구조 분석의 순서 단백질 선택 및 클로링 단백질 발현 및 정제 단백질 결정화 및 최적화 X-ray 회절 데이터 수집 중금속 도입 (MAD, MIR) MR 구조 규명

4. Principles of protein crystallization • underdeveloped area, trial-and-error procedure • The purer the protein, the better the chance to grow crystals (95%) • - homogeneous in size and surface charge!- purification ! • - purity check (SDS-PAGE, Light scattering, Native-PAGE) • 단백질은 고농도로 농축 (약 2-20mg/ml) • - 너무 높으면 결정화시 즉시 침전 • - 너무 낮으면 결정화 안됨 • 결정화에 적당한 농도란 ? • - Pre-crystallization test (Hampton Research)

5. 농축 후 precipitant와 혼합 후 결정화시도 됨. • (PEG, salts,organic solvent등) • 결정화 조건은 다양한 조건 (precipitant 농도 변화, pH 변화, 온도 변화 등) • 에서 시도된다 • - 결정화 시간은 하루에서 2-3달까지 다양하다. • 필요한 단백질의 양은 초기 결정조건 탐색을 위해서 약 5-20mg 정도 • (200-400 setup) • 회절실험을 위해서 결정크기는 약 0.2 x 0.3 x 0.1 mm으로 초기 결정조건에서 많은 경우 조건의 향상을 위한 긴 시간 (1달-6달)이 필요함.

6. Crystallization Techniques • Batch crystallization • Vapor diffusion • - Hanging drop method • - Sitting drop method • Dialysis

8. X-ray • X-ray는 0.1- 1000 Å 파장을 가지는 electromagnetic radiation이다. • 1895년 Roentgen이 발견하였고 투과성이 뛰어났다는 것은 알지만 그 성질을 자세히 알 수 없으므로 X-ray라고 불렸다. Cathod emits electrons

9. The average value for Ka1 and Ka2 is 1.54178 Å Nickel foil remove Kb radiation Monochromator

10. 전자는 electromagnetic field에서 oscillation하고 똑같은 파장을 가지는 elecromanetic Wave을 생성시킨다. X-rays are scattered exclusively by electrons and not by the nuclei.

11. Diffraction theory * Scattering 입사 된 빛이 물질과 상호작용을 하여 방향을 바꾸어 방출되는 현상으로, 에너지 변화를 수반하는 비탄성 산란 (inelastic scattering)과 그렇지 않은 탄성 충돌이 (elastic scattering)이 있다. X-선의 경우 electric component와 결정내의 전자와 상호작용을 한 뒤 에너지 변화 없이 방출되게 된다 (즉 같은 파장을 갖는다). * Diffraction - 두 개 이상의 source에서 발생하는 scattering이 상호 보강, 상쇄 간섭하여 만드는 현상. - 결정에서 발생하는 diffraction은 결정내의 원자들의 전자수, 그리고 그들의 상호 거리에 의해 결정된다. 따라서 diffraction pattern은 이러한 분자에 대한 정보 (원자의 크기와 상호거리)를 가지고 있다.

12. * Bragg’s equation : 2  d  sin = n  - 회절은 결정면 상의 원자내 전자들과 입사 X-선과의 상호작용에 의한 것이지만 이를 단순 화시켜 마치 빛이 거울면에 의하여 반사되는 것처럼 결정면 (hkl)에 의하여 회절되는 현상으로 가정 - 서로 다른 (hkl)결정면에 의하여 회절된 X-선들의 경로차가 같은 phase만큼이 되어 보강간섭을 일으키는 조건

13. * Structure factor - Origin에 존재하는 한 개의 전자에서 발생하는 scattering에 대한 상대적인 값. - 전자수 (원자량)가 늘어날수록 scattering factor가 커짐 - 실제 전자는 원자주위에 electron cloud형태로 존재하게 되 므로 한 원자의 structure factor는 ρ(r)e2πs*r dr (ρ(r)dr 은 전자밀도, e2πs*r은 각 전자의 상대적인 위치) - 단백질 분자의 structure factor는 위의 값을 모두 합한 값, 즉 F(s) = ρ(r)e2πs*r dr -> F(hkl) = ρ(x,y,z)e2π(hx+ky+lz) dxyz 우리가 구하고자 하는 단백질의 전자밀도는 위의 식을 역 변환 하여 ρ(x,y,z) = F(hkl) e-2π(hx+ky+lz)=  F(hkl) e-2π(hx+ky+lz) + iα(hkl)

14. helical ED at different resolution limits 5 Å 3 Å 2.5 Å 2.5 Å w/ model  helix appears as rod Almost all a.a. side chains are visible Only large a.a. side chains are visible

15. Peptide bond is a plane. .. Protein Chemistry

16. Trans and cis x-Pro bonds

17. Side chain !

18. Antiparallel b-sheet Parallel b-sheet

19. Ramachandran Plot Phi : N-Ca Psi : Ca-C