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第十二章 基因操作、定位与克隆

第十二章 基因操作、定位与克隆. 第一节 基因操作 一、重组 DNA 技术 (recombinant DNA technique). 2014年11月6日. （ 一） 重组 DNA 两类重要的酶 1 、限制性内切核酸酶 Restriction enzymes 限制性内切核酸酶又称限制酶。限制酶是从核酸分子内部切割 ( 水解断裂 ) 磷酸二酯键生成 DNA 片段的一种内切酶。. A A G C T T T T C G A A. Hin d III from Haemophilus influenz.

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第十二章 基因操作、定位与克隆

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Presentation Transcript

  1. 第十二章 基因操作、定位与克隆 第一节 基因操作 一、重组DNA技术(recombinant DNA technique) 2014年11月6日

  2. （一）重组DNA两类重要的酶1、限制性内切核酸酶 Restriction enzymes 限制性内切核酸酶又称限制酶。限制酶是从核酸分子内部切割 (水解断裂)磷酸二酯键生成DNA片段的一种内切酶。

  3. A A G C T T T T C G A A HindIII from Haemophilus influenz 命名：属名、种名、菌株名

  4. HaeⅢ酶的识别序列： • 5' GG CC 3' • 3' CC GG 5' • 酶切位点在GC之间，在对称轴上，产生的片段为平末端。 • 5 ' GG CC 3' • 3 ' CC GG 5'

  5. Pst I酶的识别的序列： • 5 ' CTGCAG 3' • 3' GACGTC 5' • 酶切位点在AG之间，不在对称轴上，产生的片段则为粘性末端。 • 5 ' CTGCA G 3' • 3' G ACGTC 5'

  6. Sma I CCCGGG GGGCCC 5’----CCC GGG----3’ 3’----GGG CCC----5’ 平端

  7. EcoR I GAATTC CTTAAG 5’----G AATTC----3’ 3’----CTTAA G----5’ 粘性末端

  8. 2、DNA连接酶 DNA连接酶 ---粘性末端 T4DNA连接酶 ---平末端

  9. （二）重组DNA克隆的载体及选择 特点: 1. 分子量小，结合DNA，可进入宿主细胞并扩增。 2. 酶切位点的特异性 3. 具有筛选标记 4. 具有复制起始点（克隆载体） 或启动子（表达载体） 种类: 质粒; 噬菌体; 粘粒; P1人工染色体; 细菌人工染色体 ; 酵母人工染色体

  10. DNA克隆的载体 质粒（plasmid） 0~10kb 短片段载体 噬菌体（lambda phage） 0~10kb （ <50kb ）粘粒（cosmid） 33~44kb P1人工染色体（PAC）----- P1和F因子，100kb 细菌人工染色体 大片段载体 （bacterial artificial chromosome，BAC） -------数十kb~300kb 酵母人工染色体 （yeast artificial chromosome，YAC） -------1~2Mb （大分子 DNA克隆）

  11. 1、质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子1、质粒(plasmid)—存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子 • 理想的质粒 拷贝数多; 两三个遗传筛选标志，如抗药性基因： 抗氨苄青霉素基因(ampr)、抗四环素基因(terr)；β-半乳糖苷酶基因(lac Z) , 多个限制酶的单一切点，即多克隆位点(multiple cloning sites,MCS)，多连接子, 复制起点，Ori

  12. EcoR I, Sac I, Kpn I, Sma I, BamH I, Xba I, Sal I, Pst I, Sph I, Hind III MCS多连接子 Lac Z pUC19 (2.69kb) Ori Ampr 质粒载体

  13. Plasmid Polylinkers and Marker Genes for Blue-White screening

  14. 2、λ噬菌体(λphage)和粘粒(cosmid)： • 粘性质粒(cosmid)： • 有粘端位点（COS）的质粒 • 将质粒和λ噬菌体改建的载体 • λDNA的 cos区+质粒，双链环状DNA，克隆容量：40~50kb • 用于高等生物的基因文库

  15. 粘粒 ampr BamHI cos ori Cosmid vector 37~52kb insert BamHI cos ampr Cosmid vector ~5kb BamHI cos cos insert ori

  16. SnaBI CEN4 SUP4 ARS pYAC3 11.4kb TRP1 URA3 TEL TEL 3、大片段DNA克隆载体 酵母人工染色体--YACs TEL- telomeric DNA CEN4- centromere sequence ARS- 酵母复制起点 TRP1- 与 trp mutant 互补 URA3- 选择基因 SUP4- red-white color test insert

  17. （三） 目的基因的获得和检测 1、基因文库(gene library) DNA文库 是用重组DNA技术和DNA克隆方法人工建立的。包含一个生物体或人的所有DNA序列克隆的集团。

  18. （1） 基因组文库(genomic DNA library) 血细胞 DNA Sau酶切消化 与载体重组 转化 选择性增殖

  19. （2）cDNA文库（ cDNA library ）： mRNA 逆转录成cDNA，然后克隆到质粒或噬菌体重组而形成的含有全部cDNA的集团。 (3)染色体特异的基因文库 （ chromosome specific library ） 亚基因组探针 流式细胞仪、染色体显微切割技术 特异区带重组成黏粒或YAC、BAC文库

  20. 2、基因文库的筛查—杂交分离目的基因 （1）探针的种类 DNA探针 RNA探针 简并探针 人工合成 寡核苷酸探针 单一EST探针 cDNA

  21. (2)探针的标记 放射性同位素标记： 缺口平移法 随机引物法 (nick translation) (random-primed labeling) 32P、35S、3H 放射自显影 非同位素标记：Bio-11-dUTP(生物素) Dig-11-dUTP(地高辛)

  22. 二、分子杂交分子杂交：应用特异探针在复杂的靶DNA中，根据碱基的互补性来鉴定与其同源的DNA分子片段。二、分子杂交分子杂交：应用特异探针在复杂的靶DNA中，根据碱基的互补性来鉴定与其同源的DNA分子片段。

  23. 分子杂交技术方法 （一）点印迹 • 1、斑点杂交(dot and slot hybridization) • 2、等位基因特异性寡核苷酸杂交 (allele specific oligonucleotide, ASO) （二）Southern印迹法(Southern blot) （三）Northern印迹法(Northern blot) （四）Western印迹法(Western blot)

  24. βA βA βA βs βs βs βA βA βA βs βs βs ASO探针斑点杂交鉴定镰型细胞贫血的突变 斑点印迹 杂交 βA -ASO 5′ TG ACT CCT GAG GAG AAG TC 3′ βA5′GTC CAC CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT GCC 3′ 合成ASO Glu Val βs5′GTC CAC CTG ACT CCT GTG GAG AAG TCT GCC 3′ 合成ASO βs -ASO 5′ TG ACT CCT GTG GAG AAG TC 3′ 杂交 斑点印迹

  25. 基因组DNA DNA限制片段 含有EB染料的 琼脂糖凝胶 基因组DNA 高盐缓冲液 标准分子量DNA 重 物 玻璃板 吸引滤纸 凝胶 硝酸纤维素膜 与探针杂交的 基因DNA片段 X底片 Southern 杂交法

  26. CCT-GAG-G GGA-CTC-C CCT-GTG-G GGA-CAC-C CCTTAGG GGAATCC CCTTAGG GGAATCC CCTTAGG GGAATCC CCTTAGG GGAATCC 1.2kb 0.2kb 镰型细胞贫血突变MstII片段产生的特异性RFLP • Mst II识别的序列为CC↑TNAGG βA5′- 3′- - 3′ - 5′ 突变 - 3′ - 5′ βs5′- 3′- 酶切、电泳 1.4kb(βs 特异） 1.2kb(βA特异） βA βA βA βs βs βs

  27. 三、聚合酶链反应 PCR

  28. PCR的原理

  29. 1、 引物 2、 三磷酸核苷 3、 缓冲体系：Mg2＋ Taq酶

  30. 第二节 基因定位 • 基因定位：(gene mapping) 利用一定的方法将一个基因确定到染色体上的实际位置。

  31. 一、 连锁分析在基因定位中的 作用 （一）连锁分析(linkage analysis) • 是最早的传统基因定位方法，又与现代生物技术结合发展为基因作图的基本方法。基因在染色体上呈直线排列，不同的基因在同一染色体上相互连锁。利用这种连锁关系，分析被定位的基因与另一基因在染色体上相互位置而定位。

  32. 连锁分析

  33. Recomnbination fraction 重组率 1% 遗传图距 1 cM

  34. （二）遗传标记 1、第一代遗传标记—限制性酶切片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 2、第二代遗传标记—微卫星DNA (Micro-satellite DNA) 数目变异的串联重复 （variable number repeat,VNTR) 短串联重复序列 (short tandem repeat,STR) 3、第三代遗传标记—单核苷酸多态性(SNP)

  35. 100/50 60/40 50/60 100/60 100/40 50/40 100/40 50/60 100/40 100 50 40 60 父 母 连锁分析—— 1、标记位点必须与致病 基因连锁。 2、标记位点必须具有 多态性。 单基因分析、多基因分析

  36. 连锁分析——

  37. 二、 体细胞杂交与基因定位 • （一）体细胞杂交在基因定位中的作用 • 1、细胞融合过程 细胞膜融合 细胞质融合 → 异核细胞 细胞核融合 → 合核细胞 → 杂种细胞

  38. 2、杂种细胞的染色体丢失 • 杂种细胞在增殖传代过程中，出现保留一方染色体、另一方的染色体则逐渐丢失的现象。 • 结果产生保存有或多或少人染色体的各种稳定的杂种细胞系。

  39. 3、杂种细胞的选择和分离 • 细胞融合时，培养中有大量末融合的双亲细胞，这就需要进行选择分离纯化所需要的杂种细胞。为此需要制造一种只让杂种细胞生存而双亲细胞死亡的环境，利用杂种细胞和双亲细胞对生长条件要求和代谢的差异来进行选择。 • 基本方法是依据基因互补的原理，利用二者对某种药物耐受力的不同，组成一种特异的培养基，即有效的选择系统，把需要的杂种细胞从双亲细胞中选择出来。

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