Д омены

1. Домены Определения Методы разделения структуры на домены Классификации

2. Что такое “домен”? • Три определения: • По функции • По структуре • По последовательности

3. Минимальная часть полипептидной цепи, которая достаточна в эксперименте для сохранения одной из активностей целого белка может автономно свернуться в правильную, нативную структуру Функциональный домен (биохимия/биоинженерия)

4. Derbyshire et al., PNAS, 94, 11466-11471(1997)“Genetic definition of a protein-splicing domain: Functional mini-inteins support structure predictions and a model for intein evolution” Рекомбиназа A из Mycobacterium tuberculosis (790 а.о.) содержит интеин (440 а.о.) – мобильный элемент, обладающий способностью автономно вырезаться из полипептидной цепи (явление белкового сплайсинга) Интеин обладает также эндонуклеазной активностью

5. По сходству последовательностей с другими более изученными интеинами, в т.ч. интеином с расшифрованной РСА структурой (1VDE), была высказана гипотеза о том, что за две разные активности отвечают разные домены. При этом за белковый сплайсинг отвечает домен, который составлен из N-концевого и C-концевого участков полипептидной цепи

6. Для проверки гипотезы авторы создали 21 конструкт генов интеина, в которых удалены разные внутренние участки полипептидной цепи. Конструкты были встроены в ген другого белка (тимидилатсинтазы, TS) и экспрессировались в E.coli Активность проверялась по наличию нативного белка TS (без вставки интеина)

7. Результат: белковый сплайсинг сохранялся в тех случаях, когда удаленный участок не затрагивал первые 96 и последние 35 а.о. Вывод авторов: функциональный домен автономного белкового сплайсинга состоит из остатков 1-96 и 406-440 (всего 131 из полных 440)

8. Структура гомологичного белка PI-SceI – хоминг эндонуклеазы из дрожжей(PDB код 1VDE) Эндонуклеаза 186-405 Интеин 1-181, 416-454

9. Площадь контакта доменов не такая уж и маленькая.Белок димеризуется

10. Последовательность интеина консервативна.Об этом свидетельствуют доменные архитектуры трех белков из разных грибов, описанные в PFam Доменная структура белкаPI-SceI Доменная структура полноразмерного белкаVMA1 Доменная структура полноразмерного белкаTFP1(аннотирован по сходству)

11. Длинный непрерывный участок полипептидной цепи, который эволюционирует существенно медленнее других участков замечен в перемешивании доменов (domain shuffling) Эволюционный домен(биоинформатика: последовательности)

12. Белки, содержащие два эволюционных домена: гомеодомен и OAR домен (N-концевые участки не показаны)

13. Гомеодомены активно перемешивались в эволюции. Гомеодомен Парный домен и гомеодомен Об этом можно судить по 65(!) различным доменным архитектурам гомеобелков, представленным в банке Pfam Lim домены и гомеодомен Гомеодомен, продолженный Лейциновой молнией POU домен и гомеодомен Два гомеодомена PBX-домен и гомеодомен

14. OAR- домен, обнаруженныйтолько в некоторых гомеодоменных транскрипционных факторах • Консервативность наблюдается • В перемешивании доменовпока не замечен • Образует структурный домен? - нет аргументов за;против – слишком короткий • Функция не установлена

15. Пример консервативности, которую трудно характеризовать как домен: гексапептид антеннапедиа

16. Обособленная в пространстве частьбелка, его структурная единица, имеющая сравнительно мало контактов с другими частями белка собственное гидрофобное ядро Структурный домен(биоинформатика: 3D структуры)

18. Пептидаза, а за одно и димеризационный домен Двудоменный транскрипционный фактор – репрессор из бактериофага P22 (PDB код 1QAR):два оче-видных домена связаны гибким линкером ДНК-связывающий домен

19. P22 репрессор димеризуется ….

20. … и связывается с ДНК Сайт связывания – палиндром. Весь комплекс обладает (неполной) симметрией 2го порядка ATTTAAGACTTCTTAATT

22. Домен белка XXX(жизнь) Часть белка, названная доменом • Субъективизм • Образность • Традиция

23. Product RNA Fingers Template RNA Thumb NTP Palm В полимеразах обычно определяют три домена: fingers, palm, thumb

24. Но не всегда… Разные определения часто дают похожие результаты!

25. Парный домен из транскрипционного фактора PAX5 человека (PDB 1K78) 19-81A 82-90A 91-142A Эволюционный домен (PAX в Pfam) включает оба структурных домена (126 а.о.)

26. Полипептидные цепиобоих структурных доменов имеют общую топологию (- одинаковое число спиралей, - одинаковы межспиральные взаимодействия, - одинаковый порядок следования спиралей вдоль цепи; * минорные элементы вторичной структуры не в счет!)

27. N-концевой структурный доменпарного домена хорошо совмещается с C-концевым Синий – N-концевой Зеленый – C-концевой Совмещение – по двум спиралям, всего по14 Cатомам Rmsd = 0.5 Å

28. Структурные домены парного домена одинаково расположены на ДНК

29. Карта локального сходства последовательностей двух структурных доменов эволюционного домена PAX/Prd из белка PAX5 человека Достоверного сходства последовательностей не наблюдается

30. При этом последовательности PAX/prd доменов консервативны по всех длине

31. Методы детектирования Структурные домены

32. На чем основаны методы • Домен имеет собственное гидрофобное ядро(пример: алгоритм DETECTIVESwindells, 1995) • Домен – это часть белка, внутри которой много контактов аминокислотных остатков, а между доменами – мало контактов (пример: алгоритм DOMAK, Siddiqui&Barton, 1995)

33. Siddiqui&Barton, 1995: DOMAK • Предпосылки: домен состоит из одного или двух непрерывных участков полипептидной цепи • Число контактов остатков внутри домена больше чем число междоменных контактов Сверху – вниз, от целого – к части!

34. Формализация • Два остатка контактируют если расстояние между ними меньше 5Å • Если белок разбит на две части, A и B, то определяется индекс разделенности: SplitValue=(intA/extAB)*(intB/extAB) intA – число пар контактирующих остатков из A; intB – число пар контактирующих остатков из B; extAB – число пар контактирующих остатков, один из A, а другой – из B

35. Пример. Структура 1CD4.Часть A: N-конец полипептидной цепи до остатка i; часть B – от (i+1) до C-конца График зависимости индекса разделенности от номера граничного остатка

36. Деление по остатку 97 (пик на графике)

37. В алгоритме DOMAK проверяются следующие разделения на части A и B

38. Алгоритм • К полной цепи применяются методы 1 и 2. Выбирается разделение с лучшим индексом • К полученным двум доменам применяется та же процедура. В случае, когда домен состоит из двух сегментов, применяется также метод 3. • Алгоритм останавливается в зависимости от пороговых значений: • MDS – минимальный размер домена (в числе остатков) • MSS - минимальный размер сегмента • Отдельная процедура предусмотрена для сегментов, длина которых между MDS и MSS • Найденные домены проверяются на “компактность”; некомпактные – сливаются в один

39. Swindells, 1995DETECTIVE Снизу – вверх, наращивание частей! Предпосылки: каждый домен имеет свое гидрофобное ядро.

40. (1) Построение кластеров гидрофобно взаимодействующих неэкспонированных остатков • Отбираются остатки, которые • Слабо экспонированы (<7%) • Принадлежат спиралям или тяжам • Более 75% контактов их атомов с другими атомами классифицируются как гидрофобные Контактом считается сближение “тяжелых” атомов на сумму vdW радиусов + 1 ангстрем Гидрофобным контактом считается контакт углеродов

41. Два остатка из отобранных считаются взаимодействующими гидрофобно если число гидрофобных межатомных контактов превосходит число негидрофобных межатомных контактов

42. Строится граф: • Вершина – отобранный остаток • Ребро соединяет вершины, если соответствующие остатки гидрофобно взаимодействуют • Связные компоненты графа, содержащие 5 или более остатков, называются гидрофобными ядрами

43. Граф гидрофобных контактов (пример)

44. Гидрофобные ядра – еще не домены! Для получения доменов применяется многоходовая процедура чистки-слияния

45. Алгоритм демонстрируется на примере (см. рис.) • найдено 3 кластера – 1й, 2й и 3й • остатки, окруженные “чужими” вычищаются • кластеры меньше чем из 5и остатков вычищаются • заливка некластеризованных остатков • оставшиеся некластеризованные остаткиприсоединяются по контактам к кластерами предыдущего шага • - (8) опять прочистка, заливка и присоединение хвостов

46. Структурная классификация доменов • SCOP (Murzin, Benner, Hubbard, Chotia, 1995) • CATH (Orengo et al., 1993, 1997) • FSSP (Holm&Sander, 1993) • другие

47. Structural Classification of Proteins, SCOP • Экспертное выделение доменов • Экспертная классификация

48. Уровни классификации в SCOP • Класс • Укладка (fold) – сходная топология • Суперсемейство – структурная гомология (?) • Семейство – сходство последовательностей и/или хорошее пространственной выравнивание цепей • Белок – б.м. ортологичные белковые домены • Вид – конкретный белок

50. Классы Основные • Альфа-спиральные домены(202 фолда) • Бета-структурные домены (141) • Альфа/бета структурные домены (a/b) (130) (бета-альфа-бета структурные единицы) • Альфа+бета домены (a+b) (260)(разделенные альфа спиральные и бета-структурные области)