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实验一 质粒 DNA 的提取及浓度测定

实验一 质粒 DNA 的提取及浓度测定. 目的与要求 通过质粒的一些特性、质粒 DNA 的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒 DNA ， 了解用分光光度计测定 DNA 含量的方法。. 2. 相关知识及原理. 质粒 (Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链 DNA 分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。. 细菌质粒 : 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从 1K-200Kb ，它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。. 质粒类型：

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实验一 质粒 DNA 的提取及浓度测定

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Presentation Transcript

  1. 实验一 质粒DNA的提取及浓度测定

  2. 目的与要求 • 通过质粒的一些特性、质粒DNA的提取、测定，学习用碱变性法提取质粒DNA， 了解用分光光度计测定DNA含量的方法。

  3. 2. 相关知识及原理 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。

  4. 细菌质粒: 细菌质粒是用的最多的质粒类群，其大小从1K-200Kb，它们复制时利用宿主细胞复制自身染色体的同一组酶系。

  5. 质粒类型： • 严谨型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； • 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。

  6. 载体(Vector)： 用于携带重组DNA，并且能够使外源DNA一起复制与表达的质粒(运载工具)。 • 具备的条件： • 易于鉴定； • 在受体细胞中可以独立复制； • 易于筛选； • 易于导入受体细胞。

  7. 质粒结构： • 抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) • 启始复制子（ori, Origin of replication)； • 多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； • 标记基因(Marker gene, such as LacZ gene)。

  8. 原理： DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。

  9. SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。

  10. 细菌裂解的方法： • 碱裂解法：0.2molNaOH+1%SDS • 煮沸裂解法:沸水煮沸40秒 • SDS裂解法：10%SDS,一般用于质粒大量提取。

  11. DNA浓度的测定： 测定DNA浓度的方法有两种，即利用分光光度计法测定DNA的紫外光吸收值；另一种方法是测定样品中溴化乙锭发射的荧光的强度来计算核酸的含量。

  12. 紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。紫外光吸收法：因为组成核酸的碱基(G,A,T,C）在260nm处具有强吸收峰，所以通过测定260nm的吸收峰即可对DNA进行定量。但有时也会因为所处溶液的pH值不同而导致吸光系数的不同。因此，一般在中性pH值左右的环境中进行测定。这种方法常用于测定比较纯的样品。

  13. 溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。溴化乙锭荧光强度法：当DNA含量很低以及样品中杂质含量高时，会影响紫外光吸收值的测定，这时，可以采用测定嵌入DNA中溴化乙锭分子受紫外光激发而发射出的荧光强度，因为这种荧光的强度与DNA总质量数成正比。

  14. 3. 材料与试剂 材料:含有质粒pCMV-Myc-T10的大肠杆菌DH5α。 pCMV-Myc是一种哺乳细胞表达载体，它含有一个N端c-Myc 尾，常用于免疫反应的检测和蛋白纯化以及作为诱饵蛋白检测酵母双杂交结果。 • Suitable host strains: DH5a, HB101, and other general purpose strains. • Selectable marker: plasmid confers resistance to ampicillin (100 mg/ml) to E. coli hosts. • E. coli replication origin: pUC • Copy number: ~500

  15. EcoR1 Insert 1.9kb Xho1 pCMV-Myc-T10

  16. 4. 步骤 • 质粒DNA的提取 • 碱裂解法

  17. 溶液1－GET缓冲液： 50mmol/L葡萄糖， 10mmol/L EDTA，20mmol/L 20mMTris-HCl pH8.0， 100g/ml RNas A 4oC 保存。 溶液2－0.2mol/L NaOH, 1%SDS 溶液3－乙酸钾溶液(3M, pH=4.8)： 60mL的5mol/L KAc, 11.5ml冰醋酸， 28.5mL H2O TE缓冲液: 10mmol/L，Tris-HCl, 1mmol/L，EDTA ， pH8.0, 100%乙醇，70％乙醇

  18. 质粒小量提取的方法： • 培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基，37℃培养12～16小时; • 取液体培养液1.5-3ml于Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液，加入100l溶液1 ，充分混匀; • 加入200l新配制的0.2mol/L NaOH(内含1％SDS)，加盖颠倒6-7次使之混匀，冰上放置5min;

  19. 加入150  l乙酸钾溶液(pH4.8)，加盖后颠倒6-7次混匀，冰上放置5－15min; • 用台式高速离心机，10000r/min离心7min，上清移入另一干净离心管，并加1ml 100％乙醇混匀，12000r/min离心5min，弃去上清液; • 沉淀用70％乙醇清洗一次，小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥; • 加入30-50l灭菌蒸馏水或TE 缓冲液溶解提取物，室温放置15-30min，使DNA充分溶解(有时需要酚:氯仿抽提); • 将分离出的质粒DNA置于-20℃保存备用。

  20. WizardTM Plus Minipreps DNAPurification System (Promega) This purification system is silica membrane-based and modified alkaline lysis procedure based system, which specifically absorbs DNA in the presence of high concentration of some salt. Proteins and other impurities are not absorbed and will be removed. DNA can be eluted under low-salt condition or water. The yield of plasmid DNA will vary depending on a number of factors.

  21. Cell Resuspension Solution • 50mM Tris-HCl (pH 7.5) • 10mM EDT • 100µg/ml RNase A • Cell Lysis Solution • 0.2M NaOH • 1% SDS • Neutralization Solution • 1.32M potassium acetate (pH 4.8) • Column Wash Solution • 80mM potassium acetate • 8.3mM Tris-HCl (pH 7.5) • 40µM EDTA • 55% ethanol • TE buffer (1X) • 10mM Tris-HCl (pH 7.5) • 1mM EDTA

  22. 注意： • 用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA); • 加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！！！

  23. Pellet 1–3ml of cells by centrifugation for 1–2 minutes at 10,000 × g in a microcentrifuge. Pour off the supernatant and blot the tube upside-down on a paper towel to remove excess media. • Completely resuspend the cell pellet in 200µl of Cell Resuspension Solution (Solution I）. • Add 200µl of Cell Lysis Solution (Solution II) and mix by inverting the tube 4 times. The cell suspension should clear immediately.

  24. Add 200µl of Neutralization Solution (Solution III)and mix by inverting the tube 4 times. • Centrifuge the lysate at 10,000 × g in a microcentrifuge for 10minutes. • Pipet 1ml of the resuspended resin into each barrel of the Minicolumn/syringe assembly. (If crystals or aggregates are present, dissolve by warming the resin to 25–37°C for 10 minutes. Cool to 30°C before use.)

  25. Carefully remove all of the cleared lysate from each miniprep and transfer it to the barrel of the Minicolumn/syringe assembly containing the resin. No mixing is required. • Carefully insert the syringe plunger and gently push the slurry into the minicolumn. • Detach the syringe from the Minicolumn and remove the plunger from the syringe barrel. Reattach the syringe barrel to the Minicolumn.

  26. Pipet 2ml of Column Wash Solution (after the addition of ethanol) into the barrel of the Minicolumn/syringe assembly. Insert the plunger into the syringe and gently push the Column Wash Solution through the Minicolumn. • Remove the syringe and transfer the Minicolumn to a 1.5ml microcentrifuge tube. Centrifuge the Minicolumn at 10,000 × g in a microcentrifuge for 2 minutes to dry the resin.

  27. Transfer the Minicolumn to a new 1.5ml microcentrifuge tube. Add 50µl of nuclease-free water to the Minicolumn and wait 1 minute. Centrifuge at 10,000 × g in a microcentrifuge for 20 seconds to elute the DNA. • The DNA will remain intact on the Minicolumn for up to 30 minutes; however, prompt elution will minimize nicking of plasmids in the range of 20kb.

  28. Remove and discard the Minicolumn. Follow these storage recommendations: • DNA is stable in water without addition of a buffer if stored at –20°C or below. DNA is stable at 4°C in TE buffer. To store the DNA in TE buffer, add 5µl of 10X TE buffer to the 50µl of eluted DNA.

  29. B. 用分光光度计法定量DNA • 取2l提取的质粒DNA，加入98l蒸馏水对待测DNA样品做1:50(或更高倍数的稀释); • 蒸馏水作为空白,在波长260nm、280nm处调节紫外分光光度计读数至零。

  30. 加入DNA稀释液，测定260nm及280nm的吸收值。260nm读数用于计算样品中核酸的浓度，OD260值为1相当于约50g /ml双链DNA，33g /ml单链。可根据在260nm以及在280nm的读数的比值（OD260/OD280）估计核酸的纯度。一般DNA的纯品，其比值为1.8，低于此值说明有蛋白质或其它杂质的污染。

  31. 记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下:记录OD值，通过计算确定DNA浓度或纯度，公式如下: • dsDNA=50×(OD260) × 稀释倍数 • 以上浓度单位为g /ml

  32. 5. 实验报告 • 目的与要求 • 实验原理 • 材料与方法 • 结果与讨论

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