实验三 IgG 的分离和纯化

1. 实验三 IgG的分离和纯化

2. 一、实验目的 1、实践IgG 分离纯化过程。 2、了解分离、纯化抗体的原理。

3. 二、实验原理 对免疫球蛋白的分离纯化有两方面的含义：一是从理化性质上提取均质的免疫球蛋白部分，去除杂质蛋白、提高免疫球蛋白的含量。二是从免疫学角度上提取对某种特定抗原的特异性抗体，这种特异性抗体可以是几类免疫球蛋白(加IgG、IgM、IgA)的混合物。 γ球蛋白（IgG）是血清免疫球蛋白的主要成分，约占全部免疫球蛋白的75％，因此，抗体的分离纯化主要是分离纯化IgG。

4. 溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水，发生凝集而沉淀析出。不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。溶液中高浓度的中性盐离子有很强的水化能力，会夺取蛋白质分子的水化层，使蛋白质胶粒失水，发生凝集而沉淀析出。不同的蛋白质在同一浓度盐溶液中的溶解度不同，可利用不同浓度的盐溶液使每个蛋白质成分分别析出，通常称为蛋白质的盐析。

5. 许多中性盐都能使蛋白质盐析，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠和磷酸盐等。最常用的为硫酸铵，因它具有溶解度高且受温度影响较小的优点，在室温或冰箱(4℃)内均可进行。一般认为在pH7.0时，50％硫酸铵饱和度可将所有的免疫球蛋白都沉淀出来。33％饱和度时，大部分IgG可沉淀出来。40％饱和度时，沉淀物的得率最高，但含IgM、IgA等β球蛋白部分增多。许多中性盐都能使蛋白质盐析，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠和磷酸盐等。最常用的为硫酸铵，因它具有溶解度高且受温度影响较小的优点，在室温或冰箱(4℃)内均可进行。一般认为在pH7.0时，50％硫酸铵饱和度可将所有的免疫球蛋白都沉淀出来。33％饱和度时，大部分IgG可沉淀出来。40％饱和度时，沉淀物的得率最高，但含IgM、IgA等β球蛋白部分增多。 中性盐沉淀法是抗体分离和纯化的首选方法，但利用盐析法提取的免疫球蛋白，不能得到纯净的免疫球蛋白。欲获得较纯净产品，还需要结合其他方法，如凝胶过滤、离子交换、亲和层析、区带电泳等进行进一步分离纯化。

6. 三、实验材料和试剂 抗血清, 磷酸盐缓冲液，饱和硫酸铵溶液，离心机，试管等

7. 四、实验步骤 免疫血清 0.5 mL 　　　　 ↓加 0.5mL 磷酸盐缓冲液 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 1mL（此时为50%饱和度） 4℃，静置 10min↓3000 r/min 离心 10 min 　　　取沉淀溶于 1 mL磷酸盐缓冲液 　　　 ↓ 逐滴加入饱和（NH4）2SO4 0.5 mL（此时为33%饱和度） 4℃，静置 10 min↓3000 r/min 离心 10min 　 取沉淀溶于0.5 mL 生理盐水中 ↓ 　　 装入透析袋

8. 五、思考题 1、分离纯化免疫球蛋白为什么尽可能在低 温条件下进行？ 2． 常用的分离纯化免疫球蛋白的方法主要有哪几种？各自得到的纯度如何？ 3. 分离纯化IgG 时，为什么硫酸铵的饱和度先调至50%，然后调至33%？加入硫 酸铵溶液时为什么要一滴一滴的加？