ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

1. ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ

2. Генная терапия (ГТ) – совокупность генно-инженерных имедицинских методов, направленных на внесение изменений в генетический аппарат соматических клеток человека путем введения в организм рекомбинантных генетических конструкций с лечебной целью

3. Стратегии ГТ EX VIVO IN VIVO

4. Классификация ГТ • По типу векторной системы • Вирусная • Невирусная • РНК – содержащие вирусы : • Прямая инъекция ДНК в клетку, ткань, орган • Липофекция • Электропорация • «Генное ружье» • Рецептор-опосредованный эндоцитоз • ретровирусы (онкоретровирусы, • лентивирусы и др.) • ДНК – содержащие вирусы : • аденовирусы • вирус герпеса • аденоассоциированные вирусы

5. Вирусные векторы • Преимущества • трансдукция большого числа клеток • тропизм • устойчивость к деградации лизосомами • Недостатки • – иммуногенность(аденовирусы,герпесвирусы) • – потенциальная канцерогенность(ретровирусы)

6. Вирусные векторы • (на примере ретровируса) • gag кодирует большой белок-предшественник • всех основных структурных белков вирусной сердцевины • pol кодирует каталитические белки (ревертаза, протеаза, интеграза) • env кодирует гликопротеины вирусной оболочки • Ψ участок, необходимый для упаковки РНК в нуклеокапсид

7. Вирусные векторы Схема получения рекомбинантной ГТ-конструкции на основе ретровирусного вектора в клетке «упаковочной»линии ψ • Транскрипция «терапевтического» гена в ядре под контролем промоторав 5’-LTR • и трансляция в цитоплазме белков Gag, Pol, Env, кодируемых соответствующими генами вируса • в разных хромосомах • Образование вирусного капсида и упаковка двух цепей РНК и ревертазы • Высвобождение из клетки вирионов с «терапевтическим» геном

8. Вирусные векторы РНК-геном • Векторы на основе ретровирусов Преимущества • не иммуногенны • постоянная экспрессия трансгенов • (в геноме) Недостатки • инфицирование только делящихся клеток • случайное включение в геном • потенциальная канцерогенность • низкий титр вирионов, выделяемых из упаковочных линий • небольшая клонирующая емкость (до 8 - 10 т.п.н.)

9. Вирусные векторы Векторы на основе аденовирусов Преимущества днДНК-геном • способны инфицировать • неделящиеся клетки • большая клонирующая емкость • (в настоящее время до 28 т.п.н.) • высокий титр вирионов, • выделяемых из упаковочных линий • не встраиваются в геном Недостатки • иммуногенность (иммунный ответ развивается через 2-3 инъекции) • кратковременная экспрессия трансгена (не интегрирован в геном)

10. Вирусные векторы онДНК-геном Векторы на основе аденоассоциированных вирусов Преимущества • не иммуногенны • встраиваются в специфический сайт • в хромосоме 19 • не патогенны • способны инфицировать • неделящиеся клетки • длительная экспрессия трансгена Недостатки • небольшой размер клонируемой ДНК (до 4.5 т.п.н.)

11. Невирусные системы доставки • Прямая инъекция ДНК • Липофекция • Электропорация • «Генное ружье» • Рецептор-опосредованный эндоцитоз

12. Невирусные системы доставки • Преимущества • относительная безопасность • отсутствие иммунного ответа • простота применения • Недостатки • низкая эффективность трансфекции • низкий уровень экспрессии трансгена

13. Невирусные системы доставки • Внутримышечная инъекция ДНК-вакцины • Подкожное введение «генным ружьем» Недостаток • Низкий уровень экспрессии трансгена

14. Невирусные системы доставки • Липофекция с помощью катионных липосом Недостаток • Возможность деградации • в лизосомах

15. Невирусные системы доставки • Рецептор-опосредованный эндоцитоз а) ДНК ковалентно связывается с поликатионом (поли-L-лизин) и лигандом (моносахарид, дисахарид или гликопротеин), образуя ДНК-комплекс (in vitro)

16. Невирусные системы доставки • Рецептор-опосредованный эндоцитоз б) ДНК-комплекс взаимодействует со специфическим рецептором на поверхности клетки и путем эндоцитоза попадает внутрь клетки, а затем в ядро (in vivo) Недостаток • возможность деградации в лизосомах

17. Частота современного использования разных типов векторных систем в ГТ

18. Новейшие подходы в ГТ • РНК-интерференция • (непрямая коррекция генетических нарушений) • Прямая коррекция генетических нарушений • гомологическое замещение малым фрагментом (SFHR)

19. РНК-интерференция • непрямая коррекция генетических нарушений

20. Области применения ГТ в настоящее время

21. Лечение наследственных заболеваний с помощью ГТ Первое применение ГТ – лечение тяжелого комбинированного иммунодефицита, связанного с мутацией гена аденозиндезаминазы (ADA) (20 сентября 1990 года)

22. Фазы клинических испытаний генотерапевтических препаратов Фаза I→ оценка токсичности генной конструкции Фаза II→ ограниченные испытания на небольшом контингенте больных Фаза III → широкомасштабные клинические испытания Современное состояние протоколов по ГТ

23. ГТ-протоколы, проходящие II/III фазы клинических испытаний • Тяжелый комбинированный иммунодефицит (аденозиндезаминаза) • Семейная гиперхолестеринемия (рецептор липопротеинов низкой плотности) • Гемофилия В (фактор IX) • Болезнь Гоше-сфинголипидоз (глюкоцереброзидаза) • Муковисцидоз (СF-трасмембранный фактор) • Основной подход • заместительная терапия

24. Генотерапия рака 3 основных подхода: 1. Иммунотерапия рака 2. Подавление роста раковых клеток введением генетических конструкций 3. Вирусный онколизис Частота использования различных подходов к ГТ рака:

25. Иммунотерапия рака Использование ГТ- конструкций, стимулирующих иммунный (в основном клеточный) противоопухолевый ответ Для создания рекомбинантных генетических конструкций используют гены: • Антигенов • Эпитопов • Комплекса MHCI; фактора B7 • Цитокинов • Рецепторов Т-клеток

26. Стратегии антиопухолевой иммунотерапии «Генетическая коррекция» иммуногенности клеток опухоли – ДНК-вакцинация (презентация чужеродного антигена); – Введение генов комплекса гистосовместимости (MHCI); – Введение гена костимулирующего фактора T-клеток (B7) Ex vivo In vivo

27. Стратегии антиопухолевой иммунотерапии • Генетическая модификация клеток иммунной системы

28. Подавление роста раковых клеток введением в них • генетических конструкций (ДНК и ингибиторные РНК) • (или в нормальные клетки для защиты от противоопухолевой терапии) • Гены-супрессоры опухоли • Суицидные гены • Ингибиторы онкогенов • Факторы антиангиогенеза • Ингибиторы циклинов • Гены, повышающие чувствительность • клеток опухоли к лекарственным соединениям • Гены транспортеров лекарственных соединений • (введение, например, в клетки костного мозга)

29. гены-мишени p53 • bax • fas • KILLER/DR5 • NOXA • p53AIP • PUMA АПОПТОЗ АРЕСТ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА • 14-3-3σ • p21/waf1 циклины Гены-супрессоры опухоли До 80 % видов онкологических заболеваний связано с нарушением активностигена р53 Функции гена р53 в клетке

30. Ингибиторы онкогенов Мутация в гене Rasможет привести к конститутивной работе сигнальной системы запуска деления, а, следовательно, к стимуляции пролиферации клеток и ингибированию апоптоза Основные подходы к блокированию онкогенного Ras-зависимого сигнального пути: • ингибирование экспрессии белка Ras с помощью рибозимов, • антисмысловых РНК и ДНК-олигонуклеотидов • ингибирование экспрессии генов, стоящих ниже в сигнальном пути • препятствование встраиванию белка Ras в клеточную мембрану

31. Факторы антиангиогенеза Ангиогенез – процесс формированияновых кровеносных сосудов; играет существенную роль в канцерогенезе: питание раковых клеток и снабжение их кислородом Клетки опухоли характеризуются состоянием гипоксии и повышенной экспрессией ангиогенных факторов (хемокинов) ГТ-подходы к антиангиогенезу: • подавление экспрессии генов, • кодирующих хемокины • активация естественных • ингибиторов ангиогенеза • введение мутантного гена рецептора • хемокинов в клетки эндотелия сосудов, окружающих опухоль

32. Гены транспортеров лекарственных соединений Одним из подходов в ГТ рака является защита нормальных тканей от цитотоксического действия лекарственных препаратов, применяющихся при химиотерапии

33. Основные способы повышения специфичности и эффективности ГТ онкологических заболеваний • Использование специфичных и/или индуцибельных • промоторов для экспрессии терапевтических генов • опухолеспецифичные промоторы • тканеспецифичные • промоторы, индуцируемые радиоактивным облучением • промоторы, индуцируемые в условиях гипоксии • Использование «bystander» эффекта

34. Проблемы ГТ • Небезопасность генно-инженерных конструкций • Невысокая эффективность векторных систем • Кратковременная экспрессия «терапевтического гена» • Инактивация ГТ-конструкций защитными системами клетки

35. Актуальные задачи ГТ • Разработка индивидуальных алгоритмов ГТ • наследственных и ненаследственных заболеваний • Повышение эффективности векторных систем, используемых в ГТ • Регуляция места, уровня и времени экспрессии трансгенов • Разработка систем переноса ГТ-конструкций в митохондрии • Повышение эффективности ДНК-вакцин для лечения инфекционных и онкологических заболеваний

36. ГТ человека (примененные протоколы) в1989-2008 г.г.

37. Распространение протоколов клинических испытаний по ГТ (на всех стадиях)  По континентам По странам 

38. ГТ в России • В России 5-10 лабораторий, где ведутся экспериментальные исследования • Основные проекты по ГТ в России: • ГТ опухолей (противоопухолевые вакцины) • ГТ СПИДа (блокирование экспрессии генов ВИЧ) • ГТ ишемических болезней сердца (индукция ангиогенеза) • ГТ мышечной дистрофии Дюшена (заместительная терапия)

39. Заключение • ГТ пригодна для лечения широкого спектра заболеваний • Эффективность ГТ нуждается в повышении • Дальнейшее развитие и широкое использование ГТ неизбежно