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薬理学発表　実習 1 　ヘキソバルビタール代謝 （担当者） ・データ分析 　井筒、岩坪、宇佐美、喜多、久保（武）、澤井、杉本（雅）、　　　 　田口（真）、辻（裕）、牧野、森田（成）、山下（淳） ・ P-450 考察 　大西、大山、賀屋、久保

薬理学発表　実習 1 　ヘキソバルビタール代謝 （担当者） ・データ分析 　井筒、岩坪、宇佐美、喜多、久保（武）、澤井、杉本（雅）、　　　 　田口（真）、辻（裕）、牧野、森田（成）、山下（淳） ・ P-450 考察 　大西、大山、賀屋、久保（卓）、高、辻（泰）、服部、平井、 　広瀬、藤本、宮本、山下（貴）　. ヘキソバルビタール代謝. 目次. Ⅰ ．実習データとその解析 　１． Introduction 　２．ヘキソバルビタール水酸化活性の変動 　　①フェノバルビタール（ PB ）前処理 　　② β- ナフトフラボン（ β-NF ）前処理 　　③性差

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薬理学発表　実習 1 　ヘキソバルビタール代謝 （担当者） ・データ分析 　井筒、岩坪、宇佐美、喜多、久保（武）、澤井、杉本（雅）、　　　 　田口（真）、辻（裕）、牧野、森田（成）、山下（淳） ・ P-450 考察 　大西、大山、賀屋、久保

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Presentation Transcript

  1. 薬理学発表　実習1　ヘキソバルビタール代謝薬理学発表　実習1　ヘキソバルビタール代謝 （担当者） ・データ分析 　井筒、岩坪、宇佐美、喜多、久保（武）、澤井、杉本（雅）、　　　 　田口（真）、辻（裕）、牧野、森田（成）、山下（淳） ・P-450考察 　大西、大山、賀屋、久保（卓）、高、辻（泰）、服部、平井、 　広瀬、藤本、宮本、山下（貴）　

  2. ヘキソバルビタール代謝

  3. 目次 Ⅰ．実習データとその解析 　１．Introduction 　２．ヘキソバルビタール水酸化活性の変動 　　①フェノバルビタール（PB）前処理 　　②β-ナフトフラボン（β-NF）前処理 　　③性差 　３．SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE） 〈質疑応答〉 Ⅱ．P-450について

  4. １．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ 　チトクロームP450はほとんどすべての生物に存在し、 異物（薬物）代謝においては主要な酵素である。動物では 主に肝臓に存在し、NADPHの存在下で基質を水酸化する。 　予めフェノバルビタールやβ-ナフトフラボンを投与した マウスでＰ４５０の活性がどのように変化するか調べる。ま た、性差によりＰ４５０の活性がどのように違うか調べる。

  5. チトクロームP４５０とは何か？ ・別名CYP。脂溶性薬物を水溶性に変え排泄しやすくする肝細胞内（主に小胞体すなわちミクロソーム）に存在する薬物代謝酵素。蓄積すると毒になるものが多い。例えば、フェノバルビタールやポリ塩化ビフェニルなど。 ・ヒト体内においては主なものは１１種類存在し（CYP1A2、2C9、2C19、2D6、3A4etc）、全部で約100種存在する。また、細菌から植物、哺乳動物に至るほとんど全ての生物に存在し、全部で700種以上の存在が知られている。また、体内においては電子伝達系において主要な役割を果たしている。

  6. ・肝臓の他に腎、消化管、副腎、脳、皮膚などほとんど全ての臓器に少量ながら存在する。・肝臓の他に腎、消化管、副腎、脳、皮膚などほとんど全ての臓器に少量ながら存在する。 ・構造としては、分子量約45000~60000であり、約500のアミノ酸残基からなり、活性部位にヘムを持つ。

  7. ２．ヘキソバルビタール水酸化活性の変動

  8. 結果 （control）

  9. 吸光度、代謝率

  10. タンパク量、比活性

  11. 結果 （PB）

  12. 吸光度、代謝率

  13. タンパク量、比活性

  14. ① PB前処理

  15. control PB β-NF (nmol/min/nmol P-450） 2B1 0.03 1.27 0.04 42.7 2B2 0.07 0.92 0.04 8.2 2C11（♂） 1.2 0.49 0.33 22.6 変化量が多く、酵素活性の大きいものに注目する （変化量）×（酵素活性） =（1.27-0.03）×42.7+（0.92-0.07）×8.2+（0.49-1.2）×22.6 =43.872 ＋の値が出たので、PB処置後、 比活性は増加すると考えられる。

  16. t検定（両側） P=0.000934（<0.05） SD=1.858×10-2 SD=4.382×10-2

  17. t検定（両側） P=0.230（>0.05） SD=0.903×10-2 SD=3.283×10-2

  18. 結果 （control）

  19. 吸光度、代謝率

  20. タンパク量、比活性

  21. 結果 （β-NF）

  22. 吸光度、代謝率

  23. タンパク量、比活性

  24. ② β-NF前処理

  25. control PB β-NF (nmol/min/nmol P-450） 1A1 0.04 0.04 1.41 0.9 2C11（♂） 1.2 0.49 0.33 22.6 変化量が多く、酵素活性の大きいものに注目する （変化量）×（酵素活性） =（1.41-0.04）×0.9+（0.33-1.2）×22.6 =－18.389 －の値が出たので、 β-NF処置後、 比活性は減少すると考えられる。

  26. t検定（両側） P=0.00079（<0.05） SD=0.00186 SD=0.00204

  27. t検定（両側） P=0.0983（>0.05） SD=0.000903 SD=0.000179

  28. 結果 （control）

  29. 吸光度、代謝率

  30. タンパク量、比活性

  31. 結果 （性差）

  32. 吸光度、代謝率

  33. タンパク量、比活性

  34. ③ 性差

  35. control PB β-NF (nmol/min/nmol P-450） 2C11(♂) 1.2 0.49 0.33 22.6 2C12(♀) 0.01 0.01 0.01 1 2C13（♂） 0.086 0.013 0.026 1.1 ♂、♀特有のP450に注目する ♂特有のP450のHB活性の合計=1.2×22.6＋0.086×1.1 =27.2146 ♀特有のP450のHB活性の合計=0.01×1 =0.01 よって♂の方が比活性が高くなると予想できる。

  36. t検定（両側） P=0.00630（<0.05） 標準偏差:♂0.00186 、♀ 0.00214

  37. t検定（両側） P=0.00274（<0.05） 標準偏差:♂ 0.000903、 ♀ 0.000077

  38. 表にあるものを全て計算すると･･･ control 3.09×10－2(µmol/min/mg protein) PB 7.61×10－2(µmol/min/mg protein) β‐NF 1.23×10－2(µmol/min/mg protein) ♀ 0.369 ×10－2(µmol/min/mg protein)

  39. 3.ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 タンパク質を分子量によって分画する。

  40. 実験操作 • 4日間の実習で測定に使用した試料から、10種類を選択。 • Laemmli sample buffer にタンパクを加え、濃度が1mg / ml となるように調製する。 • 加熱処理した後、各試料を 9μl ずつ各レーンに入れる。 • 200V で 35 分間電気泳動。

  41. 12/6 control 12/6 ♀ 12/6 ♀ 12/7 control 12/7 PB 12/13 PB 12/13 PB 12/14 β-NF 12/14 β-NF 12/14 β-NF marker marker 分子量 (kDa) 100 75 50 37 25

  42. シトクロムP-450はどのあたりにバンドを作るのか？シトクロムP-450はどのあたりにバンドを作るのか？

  43. 12/6 control 12/6 ♀ 12/6 ♀ 12/7 control 12/7 PB 12/13 PB 12/13 PB 12/14 β-NF 12/14 β-NF 12/14 β-NF marker marker 分子量 (kDa) 100 75 50 37 25

  44. 肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？ プロトコールP7参照

  45. 肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？ アミノ酸配列から求めた分子量

  46. 肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？ 1mgのタンパクに含まれるシトクロムP-450は、 Control:(59.4×0.04+58.3×0.03+55.9×0.03+55.9×0.07+57.2×1.20+55.9×0.01+55.9×0.086)×10-9×6.02×1023×1.66×10-18 = 83.7×10-3 mg (83.7×10-3 / 1.00)×100 = 8.37% ＊1kDa=106 / (6.02×1023) mg =1.66×10-18 mg

  47. 肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？肝のミクロソーム中にどの程度含まれているのか？ 1mgのタンパクに含まれるシトクロムP-450は、 PB: (59.4×0.04+58.3×0.03+55.9×1.27+55.9×0.92+57.2×0.49+55.9×0.01+55.9×0.013)×10-9×6.02×1023×1.66×10-18 = 156×10-3 mg (156×10-3 / 1.00)×100 = 15.6% ＊1kDa=106 / (6.02×1023) mg =1.66×10-18 mg

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