病毒分子診斷範例

1. 病毒分子診斷範例 • SARS病毒 • 病毒的發現 • 2003年2月28日越南河內香港的華商陳先生 • 卡羅歐巴尼 ( Carlo Urbani)醫師，發出警告具有高度傳染性的嚴重傳染病 • 3月12日WHO正式向世人發出SARS的警訊，將此病命名為嚴重急性呼吸道症候群( Severe Acute Respiratory Syndrome， SARS)

3. 病原 • 香港大學取患者的鼻咽分泌物和血清標本，分離出一種新的冠狀病毒 • Ksiazek等利用病毒分離、電子顯微鏡、分子生物學和血清學等方法，從 SARS患者的標本中也分離到一種新型的冠狀病毒 • 德國科學家Drosten等利用細胞培養、分子生物學和血清學等方法進行研究也分離出可重新的冠狀病毒 • 2003年4月12日，加拿大和美國科學家首次公佈了SARS病毒(Tor2 )的基因組序列 • 2003年4月16日， WHO根據，正式確認SARS的病原命名為SARS相關冠狀病毒( SARS-CoV)

4. 最適生長溫度 33-35℃ • 次易引發普通感冒的病毒 • 10-15％呼吸道感染、胃腸炎 • 嬰兒及兒童（冬天、春天） • 僅有兩株分離的人類病毒株 HCoV-OC43, HCoV-229E • 核酸：正股RNA、套膜、 80-160 nm • 對酸、乙醚、乾燥較敏感 • 基因體 +RNA ： 27,000-30,000 nt (大腸桿菌 460萬bp) (人類 30億 bp)

6. SARS病毒的基因檢測 • RT-PCR， Real-time RT-PCR • 使用One-Step RT-PCR Kit將SARS病毒的RNA反轉錄成互補的cDNA，再進行PCR • SARS檢驗陽性 • SARS病毒PCR確認陽性 • 至少2種不同的臨床檢體(例如鼻咽檢體及糞便) ，呈陽性反應 • 同一種臨床檢體，但是在病程中不同的二天或多日所採取，呈陽性反應 • 使用原始臨床檢體，分別操作二種不同的試驗，或分別重複操作PCR • 同一個檢體在第二個實驗室有再現性

7. PCR操作流程中，每一批檢體應包含適當的陰性及陽性對照PCR操作流程中，每一批檢體應包含適當的陰性及陽性對照 • 操作萃取核酸時加入一個陰性對照，另於操作PCR時加入一個水樣對照 • 操作萃取核酸流程及PCR時各加入一個陽性對照 • 抑制性對照( inhibition control)：在病人檢體加入弱陽性對照組以偵測是否有抑制PCR反應之物質存在 • 操作具SARS的PCR實驗室必須採取嚴格的條件來確認陽性結果 • SARS的PCR試劑組已製成商品，包括內部對照組( internal controls)、PCR引子及流程已經發表在期刊上，各實驗室均可採行

8. SARS的PCR試驗，其靈敏度係視檢體種類及其在病程中取得的時機而定，真正的SARS病例可能會在PCR檢測中呈陰性(偽陰性結果)SARS的PCR試驗，其靈敏度係視檢體種類及其在病程中取得的時機而定，真正的SARS病例可能會在PCR檢測中呈陰性(偽陰性結果) • Positive control: CDC提供病毒培養陽性之SARS病毒之病毒液 • Negative control:水樣之檢體 • 進行SARS檢驗應在的P3或P4設備的實驗室進行

9. 生物安全防護實驗室 第一、二級：因應有中、低危險致病原微生物 第三級：因應如漢他、SARS等高傳染、致病性病毒 穿隔離衣、戴帽、防護鞋、獨立空調、 負壓的密閉空間，外有兩道隔離門 第四級: 高傳染、致命傳染病，如伊波拉病毒 或生物化學戰。負壓、獨立空間、 穿著太空衣，攜帶氧氣瓶

10. 第一級(level 1, P1) 指在一般操作情況下不具危險性或危險性極低 之生物，如大腸桿菌-12、腺病毒有關的病毒1至4型 (1)可以在公共區域內，但門須維持關閉。 (2)可在開放的桌上操作。 (3)實驗桌須是可清潔的表面。 (4)窗戶須有紗窗隔離外界昆蟲。 (5)須有可洗眼睛與洗手之設備。 (6)便衣與實驗衣不可放置一起。 (7)定期使用消毒劑清潔。

11. 第二級(level 2, P2) 危險群微生物在人類所引起的疾病很少是嚴重的，而且通常有預防及治療的方法 除了level 1之規定外須附加上 (1)須遠離公共區域且要有半關閉之門。 (2)入口處須貼上有生物危險及相關知識的標示。 (3)服務人員與管理人員須被通知材料的危險性。 (4)內須有高壓滅菌器，所有移出之物品須經高壓滅菌或化學處理。 (5)須在1級或2級生物安全操作箱內操作。 (6)在操作中須儘量避免使用會產生空氣流的設備。 (7)急救箱須放在可見之位置。 (8)抽真空管須經過濾。 (9)實驗衣須前端可封閉者，不可穿出外。 (10)須戴手套防止皮膚接觸。

12. 第三級(level 3, P3) 在人類可以引起嚴重或致死的疾病，可能有預防及治療之方法 除了level 1與level 2之規定外，須加入： (1)遠離一般工作區，須控制人員進出。 (2)須在換衣及沖洗區域。 (3)須有負壓區。 (4)空氣進入或出來須有空氣過濾。 (5)窗戶須是不可打破的且封閉的。 (6)在出口處須有不必用手即可打開的洗手槽。 (7)操作人員須訓練如何操作、處理廢物及緊急處理過程，各步驟須貼在可見之處。 (8)實驗衣前方須是封閉性的，且須在送洗前先滅菌。 (9)須有醫學監視系統。

13. 第四級(level 4, P4) 在人類可以引起嚴重或致死的疾病，但通常無預防及治療之方法 (1)須有物理性的隔離且有氣鎖之進出門。 (2)進入須得准許且須記錄，不可單獨工作。 (3)使用第三級操作箱與正壓防護衣。 (4)須有額外之通風安全與廢物處理，氣體與水須經處理。

14. SARS病毒的全基因組定序

15. 台灣的疫情

19. Molecular epidemiology of SCoV in Taiwan 全基因體定序 11株 加 拿 大 多 倫 多 中 鼎 員 工 香 港 1 越 南 新 加 坡 台 中 曾 和 平 醫 院 林 和 平 醫 院 張 台 大 勤 台 大 TW1 台 大 蔡 香 港 2 麵 攤 老 闆 高 島 屋 員 工 仁 濟 醫 院

21. Nested RT-PCR的方法 • 首先利用long-PCR的方法將SARS基因組分成 • T1組擴增下來8組產物 • T2組擴增下來7組產物 • 接著使用T1組與T2組的nested primer來分別擴增TI、T2的PCR products • 將這15組擴增下來的products做定序分析 • 將這些重疊序列組裝起來就是SARS的全基因序列

24. 鳥 牛 貓 人 豬 豬 老鼠 鳥

26. Sequencing errors, PCR artifacts, mutable sites in the genome

28. HPC 果子狸HB 獾 B 海狸 DC 家貓 CH 野兔 CM 羌 CFB 貂RD 浣熊

31. 新興病毒的檢測方法學 • 病毒培養及Random RT-PCR的方法 • 要用何種cell line養出病毒，養不出病毒顆粒，一切都是空 • Ksiazek et. al.、Drasten et al. 2003使用Random RT­PCR的方法來擴增可能的未知病毒的序列 • 得到一些bands，將這些band切下來 • 更嚴緊的條件下跑PCR • 再將PCR產物定序 • 定序好的序列做Blast比對

32. 病毒性肝炎 • A型和E型主要經由糞-口傳染 • B型、C型和D型，主要經由血液及體液傳播，常導致慢性肝病 • B型病毒性肝炎變異型基因診斷 • DNA聚合酶的結構分成，A、B 、C 、D四個區域 • 抗病毒藥 lamivudine (干安能)結合在 C區YMDD • C區第552密碼子M→V (M552V)成為YVDD變異型 • 552密碼子M→I (M552I)成為YIDD變異型

33. HBV為雙股環狀DNA，長短不一，長鏈為負鏈，短鏈為正鏈 • 負鏈DNA含有全部遺傳訊息，有6個ORF，具有雙層包膜，外層含有 HBsAg、內層核含有HBcAg及HBeAg • 抗原組成 • 表面抗原(HBsAg)：外層殼的主要蛋白，具有共同抗原決定簇a、d/y和w/r，構成HBsAg的4種亞型：adr、adw、dyr和ayw • 產生的抗體稱為 HBsAb，一種中和抗體有保護作用 • 核心抗原(HBcAg)：存在於Dane顆粒核心部位的表面，不易在血中檢測出來，但抗原性強，能刺激身體產生抗HBc抗體，無中和病毒的作用 • e抗原(HBeAg)：存於內層的殼上，是HBcAg的一部分，經蛋白酶水解並發生結構改變而產生， HBeAg可刺激身體產生抗體，此抗體 對HBV感染有一定的保護作用

34. PCR-RFLP診斷HBV YMDD變異型 • 利用兩組引子偵測HBV polymerase gene codon 552、codon 528的 gene片段 • 552的PCR產物為119 bp，528的PCR產物為191 bp • wt M552 • Nde I限制酶切割會形成99 bp及20 bp片段 • 無法被Nla Ill限制酶切割，仍為119 bp • Var V552 • 無法被NdeI限制酶切割，仍為119 bp • 以Nla Ill限制酶切割會形97 bp、22 bp片段 • Var V552 • 無法被Nde I限制酶切割仍為119 bp • 無法被Nla Ill限制酶切割，仍為119 bp0

37. 細菌分子診斷之範例 • 結核分枝桿菌 • 傳統的診斷方法是使用顯微鏡及培養，使用Ziehl-Neelsen (ZN)染色來驗證分枝桿菌 • 非特異性，常造成false-negative • 結核菌培養於Lowenstein-Jensen培養，但需要2個星期以上 • 最主要偵測 rRNA基因或重複序列的IS6110，使用其它基因序列如65 KD及38 KD蛋白序列

38. 分枝桿菌 • 結核分枝桿菌、非結核分枝桿菌、麻瘋桿菌及腐物寄生分枝桿菌 • 結核分枝桿菌是毒力最強，引起人類結核病，牛分枝桿菌引起人、牛和 狗、豬、貓、鸚鵡等結核病 • 人類免疫缺陷病毒感染者的增多，合併非結核 分枝桿菌(NTM)感染的發病率也隨之提高 • 某些非結核分枝桿菌引起的肺部疾病與結核病難以鑒別，必須藉助分生方法來分析

39. 細菌被肺泡巨噬細胞吞噬，由於硫酸腦苷脂等成分的毒性作用，使巨噬細胞無法殺死結核分枝桿菌細菌被肺泡巨噬細胞吞噬，由於硫酸腦苷脂等成分的毒性作用，使巨噬細胞無法殺死結核分枝桿菌 • 結核分枝桿菌反覆在巨噬細胞內繁殖引起巨噬細胞死亡、裂解，釋放出的結核分枝桿菌播散到全身各處或再被吞噬 • 原發病灶多見於肺尖，肺下葉的上部接近胸膜處，經淋巴管擴散至淋巴結後形成『啞鈴狀』的原發綜合症。 • 免疫反應可限制結核分枝桿菌的傳播，原發 病灶多能自愈，形成纖維化或鈣化 • 症狀包括咳嗽、消瘦、低熱、胸痛和呼吸困難

41. 抗methicillin金黃葡萄球菌的診斷 • MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus)感染可致菌血症、肺炎、心內膜炎、敗血性關節炎、骨髓炎、深部膿瘍 • 耐藥機制 • 產生Beta-lactamase內醯胺酶，分解-內醯胺類抗生素，PBPs可正常行使功能 • 產生過量的PBPs，濃度不夠的抗生素不能完全破壞細菌細胞壁合成 • MRSA的耐藥機制不屬於以上機制，其特有的mecA基因大量表達一種特殊的青徽素結合蛋白PBP2a，與內醯胺類抗生素的結合活性很低，使得這類抗生素無效

42. 細菌具有抗藥性的原因 1.製造分解抗生素的酵素或解除藥物之活性 beta-lactamase-分解青黴素類 acetyltransferase-分解氯黴素 kinase-改變胺基醣甘類抗生素 2.改變抗生素作用的標的組成或代謝路徑 增加抗生素受質產量 改變核醣體結構 修飾合成細胞壁的酵素,使可以正常合成細胞壁 改變細胞膜上蛋白質結構

43. mec 是MRSA特有的DNA序列，長約305 kb • 通常在pur-nov-his基因簇附近 • 由mecA、mecI、mecRI及200 kb的 mec相關基因組成 • PCR及DNA probe方法 • 利用 PCR或DNA probe來檢測細菌基因組中是否存在mecA基因 • 流行病學分型研究 • 脈衝場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis， PFGE )可利用此方法做流 行病學的分型 • 連續不斷變換電場來取代簡單單一的電場，會使電泳中受阻的大片段DNA在電場改變時扭轉泳動方向，使彼此擠壓現象分開來，能達到分離的目的 • 分離片段達到10 Mb

45. PFGE分型: 金黃葡萄球菌的DNA包埋在凝膠中使用Smal 限制酶切，跑I% gel，使用二個規律性變換電場電泳24小時 • 從跑出來pattern就可以做為分型的標準， Pattern愈相似親緣關係愈近。