免疫组织化学技术

1. 免疫组织化学技术

2. 何谓免疫组化 免疫组织化学是将免疫学基本原理与细胞、组织化学技术结合所建立起来的技术。应用抗原抗体可发生特异性结合的免疫学基本原理，采用带显色剂的特异性抗体（抗原）在组织或细胞原位显示相应的抗原（抗体），确定某些抗原（抗体）是否存在于细胞、组织内并检测其分布情况，由此对某些抗原（抗体）进行定性、定位及半定量检测的一项技术

3. 发展历史 这项技术本质上是一种染色及原位示踪技术，它是在酶组织化学基础上发展起来的，始于20世纪中期

4. 先后经历了，免疫荧光标记抗体技术（Coons 1940年）----免疫酶标抗体技术（Nakane 1963）----不标记酶抗体（酶抗酶复合物）技术（Sternberger 1970）----胶体金免疫标记技术和亲和标记技术（Hsu 1985）----原位分子杂交技术（Couwenhoren 1988）等阶段

5. 免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体免疫试剂，自1975年Kohler和Milstein发明了单克隆抗体制备的杂交瘤技术后，已从采用多克隆抗体转入了广泛应用单克隆抗体时代。目前商品供应的特异性第一抗体和交联第二抗体，绝大多数都为单克隆抗体

6. 技术特点（优点） 1．特异性强 专一 2．敏感性高 检测阈值达ng或pg水平 3．定位准确 即可定性、定位， 又可定量 4．三位一体 形态、功能和代谢三结合 缺点：干扰多，易出现假阳性

7. 免疫组织化学染色操作步骤 （一）组织处理与切片选择 （二）免疫染色的前处理 试剂准备（示踪，放大，标记）；消化；阻断； （三）免疫组化染色 （四）免疫染色的后处理（ 增强、衬染、封固）

8. 免疫组化的全过程 免疫动物或细胞融合，制备特异性抗体及纯化 标记物与抗体集合形成标记抗体 抗原的提取与纯化 抗原抗体反应和呈色反应 显微镜下观察结果 标本的处理

9. 组织抗原 抗体 标记物 标记抗体 1 荧光 2 酶 3 亲和技术 4 金标

10. 免疫组织化学反应原理： 组织抗原 ＋ 标记的抗原抗体复合物 标记抗体

11. 两种免疫细胞化学反应方法 间接法 直接法

12. 标本的处理 组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。 • 标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞 • 标本的固定与保存 • 酶消化处理

13. 标本的固定与保存 固定的目的：是细胞内蛋白质凝固，终止胞内酶活化反应，防止细胞自溶，保持细胞固有形态与结构，防止细胞脱落，去除干扰抗原抗体反应的类脂，最主要的是保存组织细胞的抗原性，在染色和反复清洗的过程中使抗原不致释放。 理想的固定剂： （1）能快速固定抗原 （2）防止抗原物质扩散 （3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应

14. 标本的固定与保存 各种抗原的固定

15. 标本的固定与保存 冰冻切片和石蜡切片时免疫组化中最常用的制片方法。 冰冻切片制片方法简单，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等步骤造成的抗原损失。迅速冷冻可防止冰晶的形成，避免组织细胞结构的破坏。 石蜡切片是观察组织细胞结构的理想方法，可用于陈旧石蜡包埋材料的回顾性免疫组化研究，切片薄，有连续性，蜡块可长期保存，但是抗原的保存量不如冰冻切片。

16. 抗原处理（酶消化/热修复处理） 石蜡包埋材料大都用甲醛固定保存，固定过程中由于醛键形成致使某些抗原决定簇被封闭，染色不理想，甚至出现假阴性，因而在进行免疫组化反应之前，需要酶消化或热修复处理切片，可使抗原决定簇重新裸露。 常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。

17. 抗体处理与保存 抗体是免疫组化技术的首要试剂，通常选用的高特异性、高效价的第一抗体为多克隆抗体。 抗体稀释的原则是阳性（抗原）物质着色应鲜明，背景应钱或不着色。 抗体效价越高，孵育时间越长，方法越敏感抗体稀释度应越高。

18. 免疫染色 • 标记抗体与标本中抗原反应并形成抗原抗体复合物； • 用缓冲液冲洗去未结合的成分； • 直接在显微镜下观察结果（免疫荧光直接法），或待标本显色后再用显微镜观察结果（免疫酶直接法） 免疫染色是免疫组化技术的关键步骤

19. 常用显色系统： 辣根过氧化物酶（HRP） 硷性磷酸酶（AP） 葡萄糖氧化酶（GOD）

20. （一）辣根过氧化物酶（HRP） ★ 分子量（40000），不会遮盖抗 原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性

21. ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同 颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内

22. （二）硷性磷酸酶（AP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 ● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用

23. （三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱

24. 设立对照实验 为确定结果的可靠性，在实验中必须设置对照。通常是针对第一抗体设立对照，包括阳性对照、阴性对照、替代对照、空白对照、自身对照和吸收试验等。 （1）阳性对照 用一直抗原阳性的切片与待测标本同时进行免疫细胞化学染色，阳性对照应呈阳性结果，即为阳性对照。 （2）阴性对照 用不含一直抗原的标本作对照，实验结果为阴性，即为阴性对照。阴性对照中还包括空白对照、替代对照、吸收和抑制对照等，用以排除假阳性结果。

25. 免疫组化的结果判断 免疫组织化学的结果判断应非常严谨，阳性细胞的染色分布有三种类型：胞浆型、细胞核型和细胞膜表面型。阳性细胞显色深浅可反映出抗原的浓度，并以此作为定性、定量和定位的依据。 阳性细胞的染色常定位于细胞，并于阴性细胞间有明显间隔，而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞，两者可由显著区别。

26. 几种常用的免疫组化检测技术 • 荧光免疫组织化学技术 • 酶免疫组织化学技术 • 免疫金（银）组织化学技术 • 免疫标记电镜技术 • ……

27. 免疫组化在临床病理诊断中的应用 • 标记淋巴造血组织及其肿瘤的细胞来源和细胞分化程度; • 协助肿瘤良恶性的诊断; • 鉴别低分化癌和肉瘤; • 鉴别转移癌的性质; • 协助发现骨髓、淋巴结微小转移癌灶; • 鉴别小细胞恶性肿瘤; • 癌组织耐药基因的检测; • 为癌症患者治疗方案的拟定提供依据; • 确定肿瘤组织的增殖活性; • 评估癌症患者的预后; • 检测病原体。

28. 免疫电镜技术 免疫电镜技术又称电子显微镜免疫细胞化学技术。是免疫细胞化学与电镜技术相结合的产物，即在电镜下对细胞内抗原做定性或定量的研究。其中免疫铁蛋白技术，免疫胶体金技术，免疫酶细胞化学技术等，皆为常用技术

29. 免疫细胞化学技术——细胞水平（光镜分辨率）免疫细胞化学技术——细胞水平（光镜分辨率） 电镜免疫细胞化学技术——超微结构水平 （电镜分辨率）

30. （一）组织固定与取材 要求：即要求保持良好的超微结构 ，又要求保持组织的Ag性，固定的选择不宜过强。 常用：1． 4％多聚甲醛　+1％戊二醛 2．过碘酸—赖氨酸—多聚甲醛液（PLP）

31. 缺点：经过一系列染色步骤，易损伤结构。 应用：特别适用于含抗原量较少的组织。 （二）免疫染色 1. 包埋前染色：即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。 优点： ① 抗原不易被破坏，易于获得良好的免疫反应。 ② 可在免疫反应阳性部位定位做超薄切片，检出率↑。

32. 2.包埋后染色： 组织标本经过固定脱水及树脂包埋、制成超薄切片后，再进行免疫组化染 色。由于是以贴在网上的超薄切片进行免疫染色，故又称载网染色（on grid staining ）。

33. 优点： ① Ultrastructure 保存良好。 ② 超薄切片易穿透，可标记细胞任何部位。 ③ 方法简便，（+）结果高度可重复性。 ④ 同一张切片上可进行多重免疫染色。 缺点： ① 抗原活性可能减弱或消失。 ② 树脂中的组织不易进行免疫反应。

34. 3．超薄冰冻切片：T→2.3mol/L（蔗糖）→液氮速冻→冰冻超薄切片上切片（厚于光镜片）3．超薄冰冻切片：T→2.3mol/L（蔗糖）→液氮速冻→冰冻超薄切片上切片（厚于光镜片）

35. （三）包埋 1．树脂包埋 2．低温包埋 K4 M ： 单体 ， 17.3％； 支联体 ， 2.70g； 引发剂， 0.10g。

36. （四）免疫电镜包埋前染色——前法 ① 4％多聚甲醛（0.05MPBS，PH7.2）原位固定，4℃，1h 0.05M PBS 充分洗—前 处理 ② 0.05M PBS 充分洗—前处理。 ③ PAP或ABC染色系列过程呈色。 ④ PBS洗5′×3次。 ⑤ 1％戊二醛固定30′~1h ， PBS洗。

37. ⑥ 1％锇酸固定30′~1h 。 ⑦ 常规脱水，树脂包埋。 ⑧ 半薄切片定位，超薄切片。 ⑨ 切片复染。 ⑩ 电镜观察。