Nanokinetika

1. Nanokinetika Dr. Kerpel-Fronius Sándor Egyetemi tanár Farmakológiai és Farmakoterápiás Tanszék Semmelweis Egyetem Budapest Email: kerfro@pharma.sote.hu

2. NanomedicinaNIH meghatározása • Nanotechnológiai alkalmazása a biológiai rendszerek kezelésére, diagnosztizálására, követésére és ellenőrzésére

3. Nanorészecskék nagysága

4. Molekula nagyság és komplexitás Nick C. Parexel Kerpel-Fronius S. 4

5. Hatóanyag sorsa a szervezetben (LADME) Antal I engedélyével, Budapest Változó paraméter Folyamat Kutatási terület Kioldódó mennyiség In vitro dissolució % In vivo ???? Liberáció Biofarmácia Abszorpció Felszívódó mennyiség Disztribució Metabolizmus Elimináció Koncentráció a szervezetben Farmako- kinetika Biológiai válasz Farmako-dinámia

6. Nanokarrierek nagyság megoszlásaSzebeni J nyomán 1 nm=10−9 m; C-C kötés távolsága: 0,12-0,15 nm; albumin: 4 nm; rhynovirus: 40 nm; baktérium ~ 200nm

7. Gyógyszer felszívódáskülönbözôadagolásihelyekrôl Bôr tapasz Spray Sublingualis tabletta i.m. s.c Per os Szisztémás keringés i.v. (Bh=100%) Cél molekulák szövetekben i.v. Végbél alsó 1/3 Nem felszívódott anyag + metabolizmus Kiválasztás Metabolizmus Sejtmembránánokonkeresztülifelszívódásésmetabolizmuscsökkentik a biológiaihasznosíthatóságot (Bh<100%) KERPEL-FRONIUS S.7

8. Nanotechnológia és gyógyszer bevitelAndrade et al. Nanomedicine 6:123-141, 2011. • Nanorészecskék • Inorganikus részecskék • Szolid lipid részecskék • Polimér részecskék • Nanoszférák, nanokapszulák , gyógyszer tároló részecskék • Nanokristályok • Lényegesen kisebb kristály szerkezet, megnőtt felszín/térfogat arány, nagyobb biológiai hasznosíthatóság • Polimér gyógyszerek (Pár nm átmérő) • Polimér gyógyszerek • Polimér gyógyszer konjugátumok • Polimér micellák • Dendrimérek • Liposzomák • Amfifillipid hártya, kivül hidrofób, belül hidrofil 8

9. Nanorészecskék szöveti penetrációjaAndrade et al. Nanomedicine 6:123-141, 2011 • A nanorészecskék kicsiny mérete megváltozott szöveti eloszláshoz, felhalmozódáshoz vezet, illetve következményesen toxicitást okozhatnak • 20-50 nm nagyságú részecskék bejuthatnak a sejtekbe, központi idegrendszerbe • <70 nm nagyságú részecskék beléphetnek a tüdő interstitiumába, majd innen a nyirokrendszerbe, véráramba, csontvelőbe és más szervekbe jutnak és halmozódhatnak. • Makrofágok nem ismerik fel és nem fagocitáljál a 70 nm-nél kisebb átmérővel rendelkező részecskéket

10. Részecskék megoszlása nagyságszerinti megoszlása a légzőrendszerbenAndrade et al. Nanomedicine 6:123-141, 2011 5 µm 100 nm -1 µm 1-100 nm 1- 5 µm

11. Gyógyszer adagolás a tüdőn keresztülAndrade et al. Nanomedicine 6:123-141, 2011 • Alveolaris hám vékony: 0,1-0,5 µm; 75-150 m2 felület • Intra- és extracelluláris enzim tartalom, gyógyszer efflux sejtekből kisebb mérvű mint a bélben • Nem-invazív, gyors gyógyszer hatás megjelenést biztosító adagolási út, mely a first-pass eliminációt elkerüli • 10-200 szoros biológiai hasznosíthatóság más nem-invazív eljárásokkal összehasonlítva • Nagy felszín, a felületet borító kevés folyadékban nagy gyógyszer koncentráció érhető el • Fehérje klirensz a tüdőből: mukocilliáris hatás, makrofágfagocitózis, valamint kisebb molekulasúlyú fehérjék intercelluláris transzportja a nyirok rendszer felé • Nagy molekula súlyú fehérjék transzcelluláris transzportja a nagy affinitású peptidtranszporterekkel

12. Tüdőbe adott dózis változásai leadott dózistól az abszorpcióigAndrade et al. Nanomedicine 6:123-141, 2011 Abszor- beálódott dózis Leadott dózis Lerakódott dózis Dózis az adagolóban Gyógyszer adagolást befolyásoló tényezők : légzőrendszer geometriája, humiditása, légzési kapacitás, inhalációs technika, stb Nanorészecskék, micellák ígéretes gyógyszer szállítók, de hosszú lerakódás miatt toxikusak lehetnek

13. Nanorészecskék engedélyezése Bosetti R and Vereeck L: Nanomedicine, 6:747-755, 2011 • A nanorészecskék engedélyezési eljárása bizonytalan mivel különböző anyagokból épülnek fel, sajátságos felszíni tulajdonságokkal és fokozott reakciókészséggel rendelkeznek • Engedélyezésük három engedélyezési területet érint • Gyógyszer engedélyezés • Gyógyászati segédeszköz engedélyezés • Biológiai anyagok engedélyezése • Egy egységes, nanomedicina specifikus engedélyezési eljárás kidolgozása indokolt • Követő nanomedicina termékek esetén a bioegyenlőség mellett a hatás összevetése is indokolt, mivel a nanoszerkezet jelentősen meghatározza a biológiai komponens hatásait

14. Forgalombahozatali dokumentáció A követelmények kémiai és biológiai gyógyszerek esetén azonosak

15. Biológiaihasznosíthatóság korlátozott jelentősége a hasonló gyógyszerek helyettesítési gyakorlatában Azonos vérszint Hasonló klinikai hatás Hasonló hatóanyag • Biológiaihasznosíthatóság (bioavailability) alattértjükazongyógyszermennyiséget, mely a szisztémáskeringésbekerülbármelyadagolásiútnyomán • A biológiai hasznosíthatóság hasonlóságából nem következik a farmakológiai és immunológiai hasonlóság, melyet összehasonlító klinikai vizsgálatokban kell igazolni AUC1/AUC2=1 (0,80-1,25)

16. A daganatok “Gompertz” növekedésigörbéje sejtszám • A daganatnövekedéskoraifázisaiban a növekedésexponenciális • A klinikaidiagnózisidején a növekedésmárlassú, azosztódókompartmentkicsi, a G0frakciópedignagy • A kemoterápiaeredményeitérzékenyebbdiagnosztikaieljárásokjavíhatjákazáltal, hogy a daganatokatmár a gyorsnövekedésifázisbankimutatják • A sebészetiés/vagyradiológiaieljárásokcsökkentik a daganatnagyságát, a regenerációsoránsoksejtlépazosztódásiciklusba Klinikai észlelés határa idő Kerpel-FroniusS.16

17. Citotoxikus gyógyszer koncentráció alakulása szolid tumorokban • A tumorok kapilláris ágya újonnan képződött kapillárisok rosszul organizált hálózatából áll. • Az oxigén és a tápanyagok a messzebb fekvő sejtekhez csak számos sejtrétegen keresztül jutnak el. Következésképpen a távolabbi sejtek elpusztulnak • A citotoxikus vegyületek koncentráci-hatás görbéje meredek. A távolabbi sejtek környezetében nem alakul ki effektív citotoxikus gyógyszer koncentráció • Nagy dózisú kemoterápiával még a távolabbi sejtek is eredményesen kezelhetők

18. Normál és tumor kapillárisokMcDonald DM et al. Nat Med. 2003;9:713-725 • A tumorokban található kapillárisok fenesztráltak, a kapilláris ágy hierarhikus, funkcionális szerkezete nem alkalmazkodik optimálisan a tumorsejtek vérellátási szükségletéhez

19. Szolid tumorok kezelése nanorészecskék segítségévelJain RK és Stylianopoulos T, Nat. Rev. Clin. Oncol. 7:653-664, 2010 • A rendezetlen, könnyen átjárható kapilláris hálózat, valamint a limfatikus elvezető rendszer hiánya nagy intersticiális nyomás fokozódáshoz vezet a tumorokban, mely gátolja a gyógyszerek penetrációját • Az extracellulárismatrixösszetetétele, denzitása tovább rontja a gyógyszerek diffúzióját (Különböző töltéssel rendelkező nanorészecskék fejlesztése, extracellulásrisbarrier feloldása, fellazítása)) • Nanorészecskék a tumorokban fokozott gyógyszer penetrációhoz és retencióhoz vezethetnek, azonban tumor fajták szerint eltérő az erek fenesztráltsága • Tumor sejt vagy tumor asszociált endothel kötődés előmozdítása (MAt), pH dependens gyógyszer leadás

20. Tumor intersticiális pH és pO2 változása a kapilláris távolság függvényében Helmlinger et al. Nat. Med. 3:177-182, 1997 Kritikus távolság

21. Bevacizumab kezelés tartamaVosseler S et al. Cancer Res. 65:1294-1305, 2005 Bevacizumab 6 hetes kezelés 3 héttel a bevacizumab kezelés befejezése után Kezelés előtt • A túlzott , rendezetlen kapilláris hálózat csökkentése anti-VEGF terápiával fontos bevezető lépés a kemoterápia előtt • A bevacizumab kezelést folyamatosan, a progresszió kialakulásig fenn kell tartani

22. PolietilénglikolliposzomálisdoxorubicinCoukelet al.: Drugs, 53:520, 1997 Caelyx® Polietilénglikol boritás • Lipid membrán + kapcsolt polietilénglikol(PEG) • PEG csökkenti a RES-be történő liposzomafelvételt • Preferenciális felvétel elsődlegesen a fenesztrált kapilláris hálózattal rendelkező tumorokba • Kevés felvétel a szívizomba Toxicitás • Jelentősen emelkedett kardiális toxicitást okozó kumulatív DX szint ~ 900 mg/m2 • Kéz és láb szindróma • Hematológiaitoxicitás • Infuziós reakció: kipirulás, hidegrázás, hátfájás, hipotenzió, légzési nehézség DX oldat a liposzoma belső terében Liposzoma membrán KERPEL-FRONIUS S.22

23. PolietilénglikolliposzomálisdoxorubicinCaelixDocumentation • Farmakokinetika: • 50 mg/m2Caelyx • Eloszlás 4-5 h (DX: 0.07-0.17h), • Terminálist1/2: 45-50 h (Hosszú gyógyszer hatás tartam) (DX: 8.7 h) • Vs: 4.1L ( limitált azintravaszkuláris térre (DX: 250 L) KERPEL-FRONIUS S.23

24. A csontvelő regenerációjára ható citokinek GM-CSF G-CSF CFU- G Neu CFU- GM M-CSF CFU- M Mo SCF CFU- Eo Eo Klonális expanzió CFU- GEMM Ős- sejt Ba TPO EPO SCF: stem cell factor TPO: thrombopoietin GCF: colony stimulating factor CFU: colony forming unit BFU- E CFU- E Vvs TPO; IL-11 CFU- MEG Thr Kerpel-Fronius S.24

25. Fehérje Pegilálás klinikai farmakológiai jelentősége • Vízoldékonyság fokozódása PEG hidrofilitása következtében • Molekula nagyság következtében csökken a vese kiválasztás • Csökken a hozzáférés lehetősége proteolitikus enzimek és antitestek számára • Renális és celluláris klirensz csökkentésre heti adagolás mellett 40-60 kDA molekuláris tömegű PEG a legalkalmasabb • Legjobb ha a PEG egy helyen és nem több helyen kötődik a fehérje molekulához Polietilén glikol (PEG) PEG

26. Pegilálatlan és pegilált fehérje

27. Másodnaponkénti adagolás IFN-α 2a ésPEG-IFN-α 2afarmakokinetikai jellegzetességei Hayerris JM and ChessRB. Nat Rev DrugDiscov, 2:214, 2003 • A pegilálás által meghosszabbított felezési idő tartós terápiás plazma- szintet biztosít PEG40(kDA) IFN-α 2a Hetenkénti adagolás

28. A gyógyszeradagolásidőzítése Tumor- nagyság Abszolút neutrophil szám CT 100% 4 G(M)-CSF x109 /μl 2 50% 1 0,5 Agranulocytosis miatt szepszisveszély 3 6 hét • A granulocita-(makrofág) kolónia-stimulálófaktorokfokozzák a granulocitákregenerációját, csökkentik a 0.5 X 109 /μlalattigranulocitaszámidejét, megelőzik a fertőzéseketés a szepszist • A következő KT ciklust a tervezettidőbenvagykorábbanlehetkezdeni • Magasabb KT dózisokalkalmazhatóak Kerpel-Fronius S.28

29. R Összehasonlító farmakokinetikai és farmakodinámiás vizsgálat terve Filgrastim Ratiopharm. EPAR. EMEA/H/C/824 Biológiai hasznosíthatóság, farmakodinámiás hatások • 5 és 10 μg/kg i.v., illetve s.c. • Kimosási periódus 2 hét • 56 egészséges férfi önkéntes Ratiograstim Ratiograstim Neupogen Neupogen

30. Összehasonlító biológiai hasznosíthatósági és farmakodinámiás vizsgálatok egészséges önkéntesekben E Filgrastim Ratiopharm. EPAR. EMEA/H/C/824 5 μg/kg, s.c. 5 μg/kg, s.c. ng/ml Idő (h) Ratiograstim vs Neupogen ANC^109/l 5 μg/kg, s.c. Idő (h)

31. Pegfilgrastim (Neulasta®) hatása a granulocita számra EMA: EPAR 2004 6 mg sc Doxorubicin+docetaxeltherapy Pegfilgrastim:Granulocita kolónia stimuláló faktor hoz (r-met-HuG-CSF, filgrastim) kovalens kötéssel kapcsolt singuláris 20 kDa PEG. Filgrastim termelés rekombináns DNS technológia használatával E. coli –ban

32. Pegfilgrastimfarmakokinetikai tulajdonságaiEMA: EPAR 2004 • A klirensz nem lineáris a dózissal. Emelkedő dózisok adásakor szaturálódik a neutrofilgranulocita és neutrofilprekurzor sejteken található receptorokhoz történő kötődés, a következményes intracelluláris felvétel és lebontás • Kiválasztás a vesén keresztül nem jelentős, szemben a nem pegiláltfilgrastimmal • Felezési idő: • Pegfilgrastim 46-62 óra • Filgrastim 3,5 óra, jelentős kiválasztás vesén keresztül • Direkt összefüggés észlelhető a pegfilgrastimés szérum koncentráció, ANC csúcs szint, az ANC csúcs szint eléréséhez szükséges idő, illetve az ANC emelkedés hossza között.

33. Erythropoetin szerkezete KERPEL-FRONIUS S. 33

34. Erythropoesist stimuláló EPO származékokEgrie JC és Browne JK, NephrolDialTransplant, 16 (Suppl 3) 3-13, 2001 N-kapcsolt gyökök Biológiai aktivitás O-kapcsolt gyökök T 1/2 Receptor kötődés Mikro heterogenitás, izoformák: sziálsav gyök: 9-14 ~ 30,4 kDa, ~40% szh + rHuEPO 3-N kapcsolt szénhidrát lánc Sziálsav gyök: 18 33,8 kDa, ~46%szh 4-N kapcsolt szénhidrát lánc Sziálsav gyök: 22 37,1 kDa, ~51% szh + + Darbepoietin 5-N kapcsolt szénhidrát lánc

35. MIRCERAEMA: EPAR 2007 • Metoxipolietilénglikol-epoetin beta • Kémiai kötés PEG 60 kDa és 165 aminosavat tartalmazó rekombináns DNS technológiával előállított epoietin béta között • S.c. adagolás után • tmax: 42-120 óra • T1/2: 102-216 óra • Nem-lineáris farmakokinetika, dózis emeléssel az AUC a dózis arányosnál nagyobb értéket mutat

36. MirceraEMA: EPAR 2007 A = 3,2 µg/kg mircerai.v.; B = placebo; N= 39 egészséges önkéntes

37. EPO származékok adagolása 2-4 hetente, 1 alkalommal 1-2 hetente, 1 alkalommal 1-3 alkalommal hetente 1-3 alkalommal hetente 1-3 alkalommal hetente A felezési idők jelentős szórást mutatnak az irodalomban *CERA: continuouserythropoietin receptor activator (Mircera®)

38. Immunogenitás klinikai farmakológiai következményei Biológiai gyógyszer (fehérje) Antitest termelés Nincs hatás Farmakokinetikai eltérések A bioekvivalencia vizsgálatok kérdésesek Natív fehérjék közömbösítése Funkcionális károsodás Neutralizáló antitestek Klinikai hatás- csökkenés

39. Neutralizáló antitestek által kiváltott thrombocytopeniaChun JL et al. Blood, 98:3241-3248. 2001 PEG-rHuMGDF kezelés TPO ellenes antitest koncentráció Thrombocytaszám • Pegilált-rekombináns-humán-megakaryocyta-growth and development factor