CROMATOGRAFÍA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO

1. CROMATOGRAFÍA Y COMPONENTES DE UN SISTEMA CROMATOGRÁFICO Catedrática: Dra. Silvia Echeverría, Ph.D., Depto. Fisicoquímica Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, USAC. GUATEMALA, C.A.

2. FUNDAMENTOS DE SEPARACIÓN • PRINCIPIOS GENERALES • TÉCNICAS DE SEPARACIÓN • TEORÍA MECANISMOS DE SEPARACIÓN

3. Mezclas y la necesidad de métodos de separación Complejidad de las muestras: Sangre, agua de río, alimentos licuados, entre otros. Las muestras pueden contener mezclas de solutos, micelas, coloides y otras partículas en suspensión.

4. Técnicas de separación clásicas • Separación de componentes de interés Precipitación Destilación Extracción Soxhlet

5. Extracción con disolventes Extracción con ultrasonido (USE) (Líquido-líquido) Extracción en fase sólida (SPE)

6. Extracción con Líquidos presurizados (PLE) Extracción asistida con microondas (MAE)

7. CROMATOGRAFÍA • Nombre genérico asignado a muchas y distintas técnicas de separación. El nombre se debe al botánico ruso Mikhail Tsweet, quién acuñó el término a principios de la década de 1900, cuando logró separar varios pigmentos de plantas tales como xantofilas y clorofilas, al hacer pasar soluciones de esta mezcla por columnas de vidrio empacadas con carbonato de calcio finamente dividido. Cada pigmento recorrió la columna con diferente velocidad y terminó apareciendo cada componente como bandas de color. Chroma, palabra griega para color y Graphein que significa escribir.

8. CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS • Basada en la forma en que se ponen en contacto la FASE MÓVIL y laFASE ESTACIONARIA: En COLUMNA y en PLANO. • Basada en el tipo de FASE MÓVIL: CG, CL, CFS.

9. Todas las formas de cromatografía se basan en la separación de muestras de mezclas al entrar en contacto con dos fases: fase móvil y fase estacionaria. Una de las fases se mueve en relación con la otra. Los componentes de la muestra se distribuyen entre las dos fases de acuerdo con sus solubilidades (o afinidades) relativas hacia ellas. Los componentes que no interaccionan con la fase estacionaria pasan rápidamente con la fase móvil. Al revés, los componentes que si interaccionan con la fase estacionaria, se mueven con mayor lentitud.

10. Los componentes de la muestra se mueven con velocidades determinadas por los tiempos relativos que pasan en las fases móvil y estacionaria. A su vez, dichos tiempos quedan determinados por los coeficientes departición para cada componente entre las dos fases. De esta forma, se pueden separar distintos componentes debido a la velocidad relativa con que atraviesan la fase estacionaria.

11. Se puede realizar la cromatografía de elusión (con dos fases líquidas) en varias formas distintas. En muchos casos la fase estacionaria es un disolvente (por ejemplo agua) adsorbido y por consiguiente, inmovilizado en un soporte sólido, como papel de celulosa, o sílice en una columna empacada. La muestra que se va a resolver o separar en sus partes componentes se disuelve en un pequeño volumen de un segundo disolvente que tendrá el papel de fase móvil. A continuación se agrega la solución de la muestra al soporte sólido (que contiene la fase estacionaria inmovilizada).

12. A medida que la fase móvil atraviesa la fase estacionaria, los solutos se distribuyen entre las fases de acuerdo con sus coeficientes de partición respectivos. Se pueden agregar más fases móviles para ELUIR los componentes de la fase estacionaria a distintas velocidades. (Puede imaginarse este tipo de cromatografía como una serie continua de extracciones líquido-líquido). Al final todos los componentes serán eluidos del sistema del que se trate y así la mezcla quedará separada.

13. TEORÍA DE LAS SEPARACIONES CROMATOGRÁFICAS Coeficientes de partición Todas las separaciones cromatográficas están gobernadas por coeficientes de partición KD de solutos, entre las fases estacionaria y móvil. Para un soluto S se establece un equilibrio dinámico, esto es: S móvil S estacionario

14. El coeficiente de partición o de distribución, KD, es igual a la relación de la concentración del soluto en las dos fases, tal como en la ecuación: KD = [S]est/[S]móv (croma 01) Donde KD es el coeficiente de partición y [S]est y [S]móv son las concentraciones molares del soluto S en las fases estacionaria y móvil respectivamente. En el caso ideal, el valor de KD debe permanecer constante dentro de un amplio margen de concentraciones de soluto, para asegurar que la relación misma de [S] est y [S] móv quede constante. Se puede suponer que la cromatografía efectuada bajoestas condiciones tiene comportamiento lineal, lo cuál permite hacer determinaciones cuantitativas a partir del cromatograma.

15. En la práctica, bajo la mayor parte de condiciones normales de trabajo, se puede suponer que KD esconstante, aunque a concentraciones muy altas la fase estacionaria puede volverse parcial o totalmentesaturada.

16. TIEMPO DE RETENCIÓN TIEMPO DE RETENCIÓN En esta figura se observa un cromatograma característico para una muestra que contiene un solo analito. El tiempo que transcurre luego de la inyección de la muestra hasta que se alcanza la concentración máxima del analito en el detector, se denomina Tiempo de Retención (tR)

17. El tiempo que tarda un analito en eluirse de una columna, también se suele llamar tiempo de retención o tiempo de residencia. Si un soluto en la fase móvil no interacciona en absoluto con la fase estacionaria, se moverá con la misma velocidad que la fase móvil, dicho tiempo se puede representar como tmóv y también se le denomina, en algunas ocasiones, tiempo muerto (tM). Si el analito pasa una parte del tiempo en la fM y otra parte en la fE, su velocidad de avance estará determinada por el coeficiente de partición KD y en consecuencia, distintos analitos serán eluidos de la columna en tiempos distintos que dependen de sus coeficientes de partición dentro de la columna.

18. La velocidad lineal promedio del movimiento, u, de la fasemóvil, se puede expresar de acuerdo a la ecuación: u = L/tmóv (croma 02) En donde L es la longitud de la columna. En forma similar, para cualquier pico cromatográfico, se puede expresar la velocidad lineal promedio de migración del soluto por medio de la ecuación: ṽ = L/tR (croma 03) El tiempo de retención tR de un soluto se puede relacionar con su coeficiente de partición KD expresando la velocidad de migración del soluto ṽ en función de una fracción de la velocidad de la fase móvil, tal como en la ecuación:

19. ṽ = u * (fracción del tiempo en la fase móvil) (croma 04) Sin embargo, se deben tomar en cuenta los volúmenes de las fases estacionaria y móvil, a los cuáles se les llama Vest y Vmóv respectivamente. Basados en lo anterior, la velocidad de migración delsoluto para determinado pico cromatográfico, se puede expresar así: ṽ = u * (1)/(1+KD Vest/Vmóv) (croma 05)

20. EL FACTOR DE CAPACIDAD Es un parámetro para comparar las velocidades relativas de migración de soluto en las columnas. Dicho factor k’ se puede calcular con la ecuación: k’ = (tR – tmóv)/tmóv (croma 06) En el caso ideal, k’ debe estar dentro del intervalo de 1 a 5. Si k’ es mucho menor que 1, la elución será tan rápida que será difícil determinar con exactitud los tiempos de retención. Por lo contrario, si el factor capacidad es mucho mayor que 20, los tiempos de retención serán excesivos.

21. Ejemplo para calcular k’: Si el tiempo de retención tR de un pico cromatográfico es 65 y tmóv es 30s, calcular k’, el factor de capacidad. Método: Calcular k’ de acuerdo con la ecuación: k’= (tR – tmóv)/tmóv k’ = 65 – 30/30 = 1.17 s-¹ EL FACTOR DE SELECTIVIDAD , parados solutos A y B, se define como  = K’B/K’A (croma 07) donde KB es el coeficiente de distribución para la especie más fuertemente retenida y KA es el factor de distribución para la menos retenida.

22. De acuerdo con esta definición,  siempre será mayor que la unidad. Sustituyendo una de las ecuaciones anteriores y la análoga para la especie B en la última ecuación, se obtiene, después de reordenar, una relación entre el factor de selectividad para dos analitos y sus factores de retención:  = k’B/´k’A (croma 08) Donde k’B y k’A son los factores de retención de A y de B respectivamente. La sustitución en la ecuación croma 06, para las dos especies en la ecuación croma 07 da otra ecuación que permite la determinación de  a partir de un cromatograma experimental:

23. = [(tR)B – tmóv]/[(tR)A – tmóv] (croma 09) EFICIENCIA de las COLUMNAS CROMATOGRÁFICAS Se puede describir la eficiencia de una columna ya sea en función de El número de platos teóricos N, o de la Altura de plato H (HETP). Ambas acepciones se relacionan con la ecuación de VanDeemeter, en honor del primer científico que describió teóricamente una ecuación para cuantificar la eficiencia de las columnas cromatográficas.

24. Ecuación de Van Deemeter: H = L/N H es HETP L es longitud de la columna

25. La terminología de platos teóricos y altura de plato para describir la eficiencia de las columnas usadas en cromatografía es un legado histórico de un modelo teórico de cromatografía que ya se ha superado en gran parte. El uso del término “Plato teórico” no debe concebirse como una representación física de la columna ni de su operación, más bien es un parámetro arbitrario para describir su eficiencia. La eficiencia de la columna mejora a medida que: a) Aumenta el número de platos y b) Se reduce la altura de plato. El número de platos teóricos puede variar desde algunos cientos hasta varios cientos de miles, mientras que la altura de plato puede variar desde algunos milímetros hasta algunas decenas de micras.

26. Se ha observado que un pico cromatográfico se ensancha a medida que aumenta su tiempo de retención Asimismo el tiempo de retención de un pico aumentará si se incrementa la longitud de la columna. Entonces, a medida que la longitud de la columna aumenta, los picos cromatográficos se ensanchan. Ya que el pico tiene la forma de una curva de distribución de Gauss, se puede expresar esa forma en función del ancho que abarca más o menos una desviación estándar σ. Entonces se puede expresar la desviación estándar en función de la varianza, σ² H = σ² /L (croma 10) Notar que las unidades de L son cm, las de σ² soncm², debido a lo cuál H también tiene cm como unidades y se puede concebir como relacionada con la longitud de

28. la columna que contiene a (L – σ) proporción del analito. También se puede obtener el número de platos teóricos en forma directa, a partir de un cromatograma, ya que se puede demostrar que: N= 16(tR/w)² (croma 11) Donde tR es el tiempo de retención y w es el ancho de la base del pico cromatográfico. Tal como se ha observado, el tiempo de retención de un soluto, se relaciona con la longitud de la columna. En la práctica es más fácil medir tiempos de retención en forma directa en cromatogramas y usarlos para expresar la eficiencia de la columna.

29. EJEMPLO PARA CALCULAR LA ALTURA DE PLATO TEÓRICO HETP: Un pico cromatográfico tiene un tiempo de retención de 52 s. El ancho de la base del pico equivale a 3.2 s, en la intersección de los lados de pico con la línea base. Si la columna tiene 500 cm de longitud, calcular la HETP en centímetros por plato. Procedimiento: Calcular N con la ecuación N =16(tR/w)² y luego calcular HETP con la ecuación HETP = L/N N = 16 (52/3.2)² = 16 (16.25)² = 4225 Por lo que: HETP = 50/4225 = 0.012 cm por plato

30. FORMAS DE LOS PICOS CROMATOGRÁFICOS En esta figura se observan los perfiles de concentración de los analitos A y B en dos tiempos distintos en su migración a lo largo de la columna.

31. Se puede apreciar que en el caso típico, los picos tienen la forma de una curva de Gauss de distribución normal. Las formas de dichos picos se pueden atribuir al movimiento aleatorio de las partículas de soluto, a medida que la solución atraviesa la columna. Habrá un tiempo de retención que corresponda a la cantidad máxima de moléculas de soluto que eluyen de la columna. Las moléculas de soluto sufren muchos miles de transferencias entre las fases móvil y estacionaria por las que atraviesan dentro de la columna; sin embargo el tiempo que tarda una molécula en cada fase es aleatorio e impredecible. El soluto sólo se puede mover mientras está en la fase móvil y así se concluye que si la molécula de soluto pasa más tiempo en la fase estacionaria, recorre la columna con más lentitud y por lo tanto,

32. Si la molécula pasa mayor proporción de tiempo en la fase móvil, recorrerá la columna más rápidamente. El intercambio de un soluto entre una y otra fase requiere gasto de energía y como en cualquier sistema en el que sucede una transferencia de energía, el proceso es de naturaleza aleatoria. El resultado de estos intercambios aleatorios entre las dos fases produce el ensanchamiento de los picos cromatográficos. El ancho de un pico se relaciona con el tiempo promedio que tarda un soluto en eluirse de la columna, o sea, con su tiempo de retención. Los picos cromatográficos con mayor tiempo de retención también son los más anchos.

33. ENSANCHAMIENTO DE BANDA O DE PICO • Comúnmente al fenómeno de ensanchamiento de los picos cromatográficos se le llama ensanchamiento debanda. Dicho ensanchamiento se debe a varias causas, • Efectos de la distribución de la fM dentro de la columna: El flujo es más rápido en el centro debido a efectos de resistencia (o de fricción) en las paredes, y dicho efecto se acentúa mientras más larga sea la columna. • Difusión de las moléculas dentro de la fM al pasar a lo largo de la fE: Dado que la concentración de una especie será mayor en el centro que en las paredes de la columna debido a los efectos de distribución del flujo, entonces las moléculas tienden también a

34. Difundirse hacia las orillas, debido a un gradiente de concentración. Este proceso continuará mientras haya separación cromatográfica, a lo largo de la columna. c. Difusión secundaria o parásita de los solutos: ya que muchas columnas contienen partículas de materiales en la fE, algunas moléculas de soluto se moverán en línea más recta que otras por la columna, pues pueden tener más desviaciones en su camino. Esto a su vez causará que algunas moléculas eluyan con más rapidez que otras y de esa forma se ensanchará la banda cromatográfica. d. La presencia de pequeñas zonas dentro de la columna que contengan fM “estancada”, debido al uso de empaque con materiales porosos donde la fM no pueda pasar con facilidad, puede causar también ensanchamiento de bandas.

36. CROMATOGRAFÍA EN PAPEL Las fibras de celulosa del papel pueden actuar como fase estacionaria directamente, o ser un soporte para la adsorción de una fase estacionaria líquida, como el agua, por ejemplo. En el caso común, un extremo del papel se sumerge una pequeña distancia en la cámara cromatográfica que contiene a la fM. La mezcla en solución se depositó previamente en forma de una mancha en la línea de inicio. La mancha se aplicó lo más concentrada y pequeña posible, para evitar la dispersión prematura de la muestra por lo que normalmente se siembran manchas muy pequeñas, una sobre la otra, una vez que la anterior se haya secado por completo. La fM subirá por el papel por capilaridad. Se debe colocar la tapa de la cámara para asegurar que la atmósfera que rodee al papel esté saturada con el vapor de la fM.

38. Justo antes de que el frente del solvente llegue a la orilla superior del papel, se traza otra línea con lápiz, para marcar la distancia recorrida por la fM. A continuación se saca el papel y se deja secar. Luego ya se pueden calcular los valores de Rf(Factor deretención) para cada componente, como la relación de la distancia recorrida por la mancha entre la distancia recorrida por el frente del solvente desde la marca de inicio. Rf = dist recorrida por el analito/dist recorrida por el frente del solvente Debido a que los valores de Rf no son reproducibles con más de 2 cifras significativas, pues dicho valor presenta sensibilidad a variables tales como el grosor de la fE, la humedad que contiene la fM entre otros,

39. se recurre a otro valor que resulta más representativo, conocido como Factor de Retención RelativoRx, el cuál se define así: Rx = Dist recorrida por el analito/dist recorrida por una sustancia de referencia La sustancia de referencia es generalmente un patrón interno, el cuál se define como una sustancia de identidad conocida y con alta pureza que se emplea para fines de comparación. El Rx ideal es igual a 1, pues así se confirmaría la identidad de un analito con respecto de la sustancia de referencia.

40. CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA: (Thin LayerChromatography, TLC) Conceptualmente es muy similar a la cromatografía en papel, pero permite hacer mejores separaciones y tiende a mostrar un comportamiento más reproducible. Para la TLC, se usa como fase estacionaria un sólido finamente dividido (inmovilizado sobre un vidrio, o sobre una hoja de material polimérico o de aluminio), que puede ser alúmina (Al2O3), gel de sílice, entre otros. La fase móvil puede ser agua, solución acuosa de amoníaco o alguna otra mezcla, por ejemplo, una solución de alcohol/agua/ácido acético.

41. Las placas de TLC se marcan y se revelan en forma muy similar a la que se usa para la cromatografía en papel, pero teniendo el cuidado de trazar las líneas con el lápiz (con mina de grafito) en forma delicada para evitar que la fase estacionaria de la placa se fracture, y esto afecte la separación. Con frecuencia se recubre la fase estacionaria con un material fluorescente para ayudar a visualizar los componentes a medida que se separan, siempre que los compuestos en estudio posean electrones que al ser excitados emitan fluorescencia que se evidenciará al observarlos con luz ultra violeta. También se pueden usar reactivos reveladores nebulizados sobre las placas para hacer visibles a los analitos ya separados.

42. La forma de aplicar las muestras también es similar a la utilizada en cromatografía en papel, aplicando manchas pequeñas y secándolas antes de volver a aplicarlas para concentrarlas.

45. CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA (Estudiar la presentación del grupo de Edy Jiménez)

46. CROMATOGRAFÍA DE GASES En la cromatografía de gases, los componentes de una muestra vaporizada se separan como consecuencia de su distribución o reparto entre una fase móvil gaseosa y una fase estacionaria sólida o líquida mantenida dentro de una columna. Para efectuar la separación en fase gaseosa, la muestra líquida se introduce en el inyector, en donde seconvierte en vapor, antes de pasar a la columna cromatográfica. La elución se consigue mediante el flujo constante de una fase móvil de gasinerte, conocido como gas portador,

47. O por su nombre en el idioma inglés: Carrier Gas. A diferencia de otros tipos de cromatografía, la fM no interacciona con las moléculas del analito, por lo cuál su única función consiste en transportar o acarrear al analito a lo largo de la columna. Se utilizan dos tipos de cromatografía gaseosa: a) Cromatografía de Gas-sólido (CGS) b) Cromatografía de Gas-líquido (CGL) En CGS la fM es un gas y la fE es un sólido que retiene a los analitos por adsorción física. Este tipo de cromatografía permite separar y determinar gases de bajo peso molecular, como los componentes del aire, sulfuro de hidrógeno (H2S), monóxido de carbono (CO) y óxidos de nitrógeno.

48. Sin embargo, esta variante de cromatografía ha tenido aplicación limitada debido a la retención semipermanente de moléculas activas o polares y a que a los picos de elución suelen presentar grandes “colas” como consecuencia de la naturaleza no lineal del proceso de elución. De manera que esta técnica no ha tenido una aplicación generalizada, salvo la separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular, que ya han sido mencionadas. La Cromatografía de GAS-LÍQUIDO, se basa en la distribución o reparto del analito entre una fM gaseosa y una fase líquida inmovilizada sobre la superficie de un sólido inerte o en las paredes de un tubo capilar. En 1941 Martin y Synge propusieron por primera vez el concepto de la CGL. En 1955 apareció en el mercado el primer equipo comercial para CGL.

49. A partir de entonces, el crecimiento de la aplicación de esta técnica ha sido espectacular, pues desde su introducción comercial han ocurrido muchos cambios y mejoras en los instrumentos. En la década de 1970 se hicieron comunes los integradores electrónicos y los equipos de procesamiento de datos por computadora. En las décadas de 1980 y 1990 se introdujo el uso de computadoras para el control automático de los parámetros instrumentales, tales como la temperatura de la columna, las velocidades de flujo y la inyección de la muestra, también se desarrollaron instrumentos de alto rendimiento a costo moderado y lo más importante: el desarrollo de columnas tubulares abiertas que permiten la separación de los componentes de mezclas complejas en períodos de tiempo breves.

50. COMPONENTES BÁSICOS DE UN CROMATÓGRAFO DE GASES Gas portador, Sistema de inyección de muestras, Configuraciones de Columnas y Hornos, Sistemas de detección