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凝胶层析法. 思考题（课前设疑）. 1. 层析分离技术包括哪些技术？分别叙述凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高压液相层析、疏水层析、聚焦层析的分离纯化原理。. 2. 一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段分别应采用哪些层析分离技术？. 3. 膜分离技术的原理是什么？它同一般的透析方法相比有何特点？. 4. 凝胶层析的应用范围有那几方面？. 5. 凝胶层析有何优缺点？. 6. 常用凝胶分那几类？分别叙述它们各自的应用范围及特点。. 7. 在实验中应如何选择凝胶与预处理？.
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思考题（课前设疑） 1.层析分离技术包括哪些技术？分别叙述凝胶层析、离子交换层析、亲和层析、高压液相层析、疏水层析、聚焦层析的分离纯化原理。 2.一般在粗品制备阶段和精品纯化阶段分别应采用哪些层析分离技术？ 3.膜分离技术的原理是什么？它同一般的透析方法相比有何特点？
4.凝胶层析的应用范围有那几方面？ 5.凝胶层析有何优缺点？ 6.常用凝胶分那几类？分别叙述它们各自的应用范围及特点。 7.在实验中应如何选择凝胶与预处理？ 8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨率高，适用于什么产品多分离或分析？粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，适用于产品制备那个阶段的分离？
9.什么是“类分离”和“分级分离”？ 10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果应注意那些问题和采取那些措施？ 11.凝胶用过后，有那几种保存方法？ 12.葡聚糖凝胶离子交换剂，葡聚糖凝胶和离子交换剂有何异同及特点？
凝胶层析（gel chromatography）常出现多种名称： 如凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。 凝胶层析的定义： 凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析 。
凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。 凝胶层析的优点 凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速及不影响分子生物学活性等优点。目前已被广泛应用于各种生化产品的分离和纯化。
－、凝胶层析的基本原理 凝胶层析的原理 l 分子大小不同混合物上柱； 2 洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3 大小分子分开： 4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中
凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔而只能沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，因此流程较短，向前移动速度快而首先流出层析柱；反之，相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可自由地进出凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，它们从凝胶内扩散到胶粒孔隙后再进入另
一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。一凝胶颗粒，如此不断地进入与逸出，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱。而中等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分进入颗粒，从而在大分子物质与小分子物质之间被洗脱。这样，经过层析柱，使混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。 Vt=Vo+Vi+Vg Vt=πR2h
V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。V。简称为外水体积，Vo等于被完全排阻的大分子的洗脱体积。可以用一个已知相对分子质量远超过凝胶排阻极限的有色分子，如常用的蓝色葡聚糖-2000溶液通过柱床，即可测出柱床的外水体积Vo。 Vi简称内水体积，可由g·Wr求得（g为干凝胶质量，单位为g，Wr为凝胶吸水量，以mL／g表示）。Vi也可以从洗脱一种完全不受凝胶微孔排阻的小分子溶质（如重铬酸钾）的洗脱体积Ve计算，即 Ve＝Vo＋Vi
对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示：对某物质在凝胶柱内洗脱体积Ve、Vo和Vi之间的关系可用下式表示： Ve＝Vo＋Kd.Vi 式中Ve为脱体积，它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时所流出的体积。Kd为每个溶质分子在流动相和固定相之间的一个特定的分配系数，它只与被分离物质分子大小和凝胶颗粒内孔隙大小分布有关。Kd可通过实验由Ve、Vo和Vi求得。
Ve＝Vo＋Kd.Vi 可改写为： （Ve-Vo） Kd=－－－－ Vi 当Kd＝0时，Ve=Vo，说明这种溶质相对分子质量大，完全不能进入凝胶颗粒微孔内，被排阻于凝胶颗粒之外而最先洗脱下来；
当Kd＝1时，即Ve小分子 ＝Vo＋KdVi，说明这种溶质的相对分子质量小，完全向凝胶颗粒内扩散，在洗脱过程中将最后流出柱外。 但实际上，约有1/5的内水因溶剂化作用而呈水合状态，妨碍小分子的自由扩散。故实际上Ve小分子 ＝Vo＋0.8Vi；当0＜Kd＜l时，意味着溶质分子只有部分向凝胶颗粒内扩散，Kd愈大，进入凝胶颗粒内的程度愈大；Kd＝0.5时，其洗脱体积Ve＝Vo十0.5Vi。
型号 Vt V0 Vi G-10 2 0.8 1 G-15 3 1.1 1.5 G-25 5 2 2.5 G-50 10 4 5 G-75 13 5 7 G-100 17 6 10 G-200 30 9 20 不同型号葡聚糖凝胶柱床参数
二、凝胶层析的特点 1．凝胶层析操作简便，所需设备简单。有时只要有一根层析柱便可进行工作。分离介质—凝胶完全不需要像离子交换剂那样复杂的再生过程便可重复使用。 2．分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％。
3．分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。3．分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响。 4．应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。分离的分子量范围也很宽，如Sephadex G类为102～105d；Sepharose类为105～108d。
三、常用凝胶的结构和性质 凝胶层析法常用的凝胶有天然凝胶（如琼脂粉凝胶）和人工合成凝胶（如葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）。 1．葡聚糖凝胶 葡聚糖凝胶（Sephadex）具有良好的化学稳定性，是目前生化产品制备中最常用的凝胶。
G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环氧丙烷（见右式）Cl－CH2－CH－CH2为交联剂将G类葡聚糖凝胶（Sephadex-G）的最基本骨架是葡聚糖，它是一种以右旋葡萄糖为残基的多糖，分子间主要是α-1,6-糖苷键（约占95%），分枝为l，3-糖苷键（约占5%），以1-氯-2，3-环氧丙烷（见右式）Cl－CH2－CH－CH2为交联剂将 O 链壮结构连接为三维空间的网状结构的高分子化合物（下图）
葡聚糖凝胶网孔大小可通过调节交联剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。 G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字既代表交联度，也代表特水量。X数字越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X数字越大，交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水10mL，依次类推。
2．亲脂性葡聚糖凝胶 这种凝胶既亲脂又亲水，可在多种有机溶剂中膨胀。这种凝胶在pH＞2的不含氧化剂的溶液中稳定。用低级醇为溶剂时，对芳香族、杂环族化合物仍有吸附作用。但用氯仿时则可去除对上述化合物的吸附作用，而对含羟基与羧基的化合物却有吸附作用 。 国产Sephadex LH－20可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析。很适用于脂肪酸、甘油脂、类固醇、维生素、激素类生化产品的分离。洗脱剂可用单一有机溶剂如甲醇、氯仿等，也可用混合溶剂如氯仿与甲醇的混合液。
3．葡聚糖凝胶离子交换剂 在G类凝胶上引入一些酸性或碱性基团后，则制得各种葡聚糖凝胶离子交换剂 。 如引入磺乙基（SE-Sephadex）、羧甲基（CM-Sephadex）及二乙胺基乙基（DEAE-Sephadex A）等。葡聚糖凝胶离子交换剂具有离子交换和分子筛双重作用。其结构多孔、疏松、非特异性吸附很少，层析时流速易控制，特别适用于蛋白质、酶、激素、多核苷酸等的分离纯化，以及生化制剂的除热原。
4．聚丙烯酰胺凝胶 聚丙烯酰胺凝胶也是一种人工合成凝胶，其商品名为生物凝胶P（Bio-gel-P），和交联葡聚糖一样，为颗粒状干粉，在溶剂中能自动吸水溶胀成凝胶。其由单体丙烯酰胺 和交联剂甲叉双丙烯酰胺 通过自由基引发聚会形成聚丙烯酰胺凝胶。 （见下图）。只要控制单体用量和交联剂的比例，就能得到不同型号的凝胶。
像Sephadex一样，商品聚丙烯酰胺为颗粒状的干粉，它有十分明显形成块状并粘附在一起的倾向，在溶剂中能自动溶胀成胶。 根据聚丙烯酰胺凝胶的溶胀性质和分离范围的不同，可分成10种类型。各种类型均以英文字母P和阿拉伯数字表示，从Bio-Gel P-2至Bio-Ge1 P-300。P后面的阿拉伯数字乘以1000即相当于排阻限度（按球蛋白或肽计算）。目前，美国Bio-Rad Laboratories生产并出售多种规格的Bio-Gel P。
5．琼脂糖凝胶（Sepharose） 琼脂糖凝胶（agarose gel）可以分离葡聚糖凝胶和生物胶所不能分离的大分子，使凝胶层析的分离区间扩大到大分子和病毒颗粒，其最大范围可达相对分子质量108，但是由于琼脂有强烈的吸附作用，给使用造成了困难，后来，从琼脂中分离出两个组分，一个组分为带负电荷的琼脂果胶，含有磺酸基和羧基；另一组分叫琼脂糖，它不含有带电基团，其结构是有
β-D-吡喃半乳糖和3，6脱水-L-吡喃半乳糖相结合的链状多糖。这种琼脂糖被用来进行凝胶层析，它既具有琼脂凝胶相同的分离区间，又没有吸附作用。但其稳定性远不如葡聚糖凝胶和生物胶P，强酸强碱能引起结构破坏。最好使用条件控制在pH 4～9之间，温度0～40℃，超出此范围,可能被破坏。
琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶。它的商品名因生产厂家不同而异。 瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即Sepharose2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分含量。 美国的为Bio－GA，有6个型号，即Bio-G0.5M，1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表示排阻限度。 。
英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。 丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2％，4％，6%，8％和10％。
琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。
四、凝胶层析技术 （一）凝胶的选择与处理 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。
凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。—般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图
1．类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好
的分离效果。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。
2．分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入，
第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见下图）。
不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图
凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。
葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。
（二）装柱 一般选用细长的拄作凝胶过滤。进行脱盐时，柱高50cm比较合适；分级分离时，100cm就足够了。 一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。
层析柱 （a）自制简易层祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子）
层析系统连接示意图 1．密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶； 4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪
BS－100自动部分收集器安装圈 1．反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16．换向开关（逆、顺）；17．手动开关
新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。 新装好的柱要检验其均匀性－可用带色的高分子物质如蓝色葡聚糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱，观察色带是否均匀下降。也可以对光检查，看其是否均匀或有无气泡存在。
（三）加样 由于凝胶层析的稀释作用，似乎样品浓度应尽可能大才好，但样品浓度过大往往导致粘度增大，而使层析分辨率下降（下图）。一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡秒），这样才不致于对分离造成明显影响。对蛋白质类样品浓度以不大于4％为宜。如果样品浑浊，应先过滤或离心除去颗粒后上柱。分析用量一般为每100mL床体积加样品1～2mL，制备用量一般为每100 mL床体积加样品20～30 mL，这样可使样品的洗脱体积小于样品各组分之间的分离体积，获得较满意的分离效果。
样品黏度对洗脱曲线的影响 （1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%.
样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。 样品上柱是凝胶层析中最关键的一步。理想的样品色带应是狭窄且平直的巨型色谱带。为了做到这一点，应尽量减少加样时样品的稀释以及样品的非平流流经凝胶层析床体。反之将造成色谱带扩散、紊乱，严重影响分离效果。
