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trFTIR

trFTIR. Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion. NMR und XRD: Struktur eines Proteins im Grundzustand, statisch. ?. trFTIR gibt Informationen über die Proteindynamik auf atomarer Ebene in μs bis ns Zeitauflösung unter physio-logischen Bedingungen!.

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Presentation Transcript

  1. trFTIR Atomar aufgelöste Beobachtung von Proteinen in Aktion

  2. NMR und XRD: Struktur eines Proteins im Grundzustand, statisch ? trFTIR gibt Informationen über die Proteindynamik auf atomarer Ebene in μs bis ns Zeitauflösung unter physio-logischen Bedingungen! Nutzung von trFTIR in der Bioanalytik Informationen: - Ladungsverteilung - H-Brücken - Protonierungszustände - Kinetik

  3. Differenzspektren Identifizierung und Beobachtung von reaktiven Gruppen

  4. Michelson Interferometer (Multiplexvorteil) • Gleiche Bedingungen bei jeder Messung! • Wiederholungsmessungen zur Verbessung des Signal/Rausch Verhältnisses (~ ) Apparatur Hohe Anforderungen, da Hintergrundintensität viel stärker ist, als die Intensitätsänderungen (3-5 Größenordnungen)

  5. Michelson Interferometer Apparatur L M  Z  D

  6. Zeitauflösung Reaktionsinitiierung a) Direkt über ns - Laserblitz  nur bei photobiologisch aktiven Proteinen z.B. Bacteriorhodopsin b) Photolabile Trigger-Substanzen z.B. Caged ATP c) Mischzellen  max. µs - Auflösung

  7. Zeitauflösung • Rapid Scan • Spektrenaufnahme mit schneller Spiegelbewegung  schnelle aufeinanderfolgende Aufnahme vollständiger Interferogramme - It(x) • ms - Auflösung • auf alle Reaktionen anwendbar • Step Scan • Bei fixierter Spiegelposition wird Zeitabhängigkeit des Signals gemessen - Ix(t). Wiederholung der Messung bei jeder Spiegelposition • ns - Auflösung (Detektionsbegrenzung) • nur zyklische Reaktionen (z.B. Bacteriorhodopsin), andernfalls besondere Technik notwendig

  8. Zeitauflösung Step Scan Technik Häufige Reaktionswiederholung (oft > 1000x)  genau gleiche Bedingungen! Techniken für azyklische Reaktionen: • Flow cells Austausch der Substanz - hoher Substanzbedarf - kleine Extinktionsänderungen nicht messbar (grosse Zelldimensionen) • Fokussierung des Laser/IR Strahls Messung von einzelnen Probensegmenten- 4 μm Film zwischen CaF2-Fenstern (Filmdicke ± 10%) - Aufheizung der Probe - Beeinflussung von Segmenten durch Streulicht

  9. Bandenzuordnung Austausch von Aminosäuren  Eine bestimmte Extinktions-änderung entfällt (neue Aminosäure ist unreaktiv)Problem: invasive Mutation Isotopenmarkierung Verschiebung der Wellenzahl der Extinktionsänderung (Isotopeneffekt)

  10. Beispiel für ein Step Scan trFTIR Gerät • Kommerzielles FTIR Spektrometer mit Globar, Beamsplitter, Spiegel • Farbstofflaser (Laserblitz ca. 20 ns) • Individuelle Anfertigung von Messzelle und Signalverstärker • Kommerzieller stickstoffgekühlter MCT-Detektor (Mercury/Cadmium/Tellur) mit einer Zeitauflösung von ca. 20 ns • Schnelle Photodiode, die durch Laserreflex aktiviert wird und Aufnahme der Daten auslöst • 3 mbar Vakuum im Geräteraum, um Vibration des Spiegels durch Geräusche zu minimieren • Isolationstisch und Temperaturkontrolle

  11. Zusammenfassung und Ausblick • Vorteile der trFTIR • - physiologische Bedingungen- Informationen über H-Atome und Ladungsverteilungen- Instabile Intermediate sind messbar - Kinetische Informationen Nachteil Noch keine Standardprozedur zur Vermessung verschiedener Proben verfügbar. Aufwändige, auf das Problem zugeschnittene, technische Modifikationen • Ausblick • - Standardisierung und Validation der Methoden- fs - Zeitauflösung- Theoretische Berechnung kompletter IR-Spektren und Vergleich mit dem Experiment  Struktur und Ladungsverteilung im Reaktionsverlauf!

  12. Anwendung • Fehlfunktion von Proteinen Auslöser vieler Krankheiten • Untersuchung molekularer Reaktionsmechanismen • Verständnis Struktur, Funktion und Interaktion von Proteinen • Voraussetzung Entwicklung gezielter wirkender pharmakologische Substanzen mit weniger Nebenwirkungen

  13. Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin • Aufklärung katalytische Schritte • Mechanismus stimmt mit 10 Jahre später über Röntgenstrukturanalyse • ermittelter Kristallstruktur überein Bakteriorhodopsin [2]

  14. Lichtgetriebene Protonenpumpe Bakteriorhodopsin • Retinal über Schiffsche Base • Gebunden • Wird durch Licht angeregt • Isomerisierung (pk-Änderung) • H-Brücke W402 aufgespalten • Freie OH-Gruppe W401 kann • negative Ladung des Asp 85 • nicht mehr stabilisieren • Protonentransfer von Schiffscher • Base auf Asp 85 • Arg 82 bewegt sich • Protonierter Wasserkomplex nahe der Oberfläche destabilisiert • Gibt Proton ab • Wasser aktiv beteiligt Protonentransfer im Bakteriorhodopsin mit Hilfe von Wasser [1]

  15. Wie Proteine Protonen pumpen • 1190 cm-1 • Deprotonierung • Zentrale • Protonenbindestelle • 1762 cm-1 • Protonierung • Asp-85 Differenzspektrum Protonentransfer Bakteriorhodopsin [1]

  16. Schaltmechanismus von GTPasen • RAS kontrolliert Wachstumssignal • Mutationen • unkontrolliertes Zellwachstum • GAP hydrolysiert nicht mehr • Verfolgt RAS-GTP-Hydrolyse Struktur vom Intermediat (H2PO42- ) [1]

  17. Schaltmechanismus von GTPasen • Ras(*Ras)Gap: Intermediat (1143 cm-1) • Katalyse durch positive geladene Lys, Arg und Mg2+ • Mutation Arg zu ungeladenem Gln -> Verlangsamung GTP-Hydrolyse [1] Differenzspektrum GTP-Hydrolyse [2]

  18. Pharmascreening • Nahezu alle Moleküle IR-aktiv (keine Fluoreszenzmarkierung) • Kann direkt Einfluss Pharmaka auf Protein bestimmen • z.B. Reaktivierung RAS • Studieren potentieller Pharmaka • Identifizierung aktivierender Pharmaka • Substanzen in natürlicher Umgebung studieren (RAS über Lipidanker an Membranmodelle binden die auf ATR-Oberfläche aufgetragen sind)

  19. Ausblick • Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren • Herstellung gezielter wirkender Pharmaka mit weniger Nebenwirkungen • Untersuchung Protein mit unbekannter Raumstruktur • Charakterisierung G-Proteingekoppelter Rezeptoren

  20. Literatur • Proteinreaktionen: aufgelöst mit trFTIR, Nachrichten aus der Chemie, 5 • http://www.innovationspreis-ruhr.de/Entwicklungsbeschreibung_17%2002%2006.pdf • K. Gerwert, Ber. Bunsen-Ges. Phys. Chem., 1988, 92, 978 • W. Uhrmann , A. Becker, C. Taran, F. Siebert, Appl. Spectrosc., 1991, 45, 390 • R. Rammelsberg, B. Hessling, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Appl. Spectrosc., 1997, 51, 558 • R. Rammelsberg, S. Boulas, H. Chorongiewski, K. Gerwert, Vib. Spectrosc., 1999, 19, 143

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