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Cromatograf a

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Cromatograf a

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Presentation Transcript

    1. Cromatografía

    2. Cromatografía

    3. Cromatografía

    4. Cromatografía

    5. Cromatografía

    6. Descubridor El botánico ruso Mikhail Tswett (Mikhail Semenovich Tsvett, 1872-1919)

    7. Definición Cromatografía es un método de separación en el que se aprovechan las diferencias en el comportamiento de partición entre una fase móvil y una fase estacionaria para separa los componentes de una mezcla.

    8. Cromatografía, definición (cont.) Una columna u otro soporte mantienen a la fase estacionaria y la fase móvil acarrea a la muestra. Los componentes de la muestra que particionan fuertemente con la fase estacionaria estarán más tiempo dentro de la columna.

    9. Si es en columna : Conforme los componentes son eluidos de la columna, pueden ser cuantificados por un detector y colectados para análisis posterior

    10. Métodos cromatográficos De gases En capa fina En líquidos inmovilizados De exclusión molecular Intercambio iónico Hidroxiapatita Hidrofóbica Afinidad HPLC

    11. Exclusión molecular Fase estacionaria: Dextrán con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado Poliacrilamida Las moléculas grandes fluyen más rápido que las pequeñas.

    12. Desarrollo de una cromatografía de exclusión molecular Determinación del tamaño de la columna Hidratación y lavado de la resina Empaque de la columna Determinación del volumen vacío Corrimiento de la muestra

    13. Cromatograma de exclusión molecular (EM)

    15. Cromatografía de exclusión

    16. Características de las resinas de EM clásicas

    17. Intercambio iónico

    18. Intercambio iónico Las proteínas difieren mucho en su afinidad por materiales cargados positiva o negativamente. Los soportes pueden ser: Dextrán con enlaces cruzados Agarosa con enlaces cruzado Poliacrilamida Celulosa Poliestireno Sílice

    19. Grupos intercambiadores Carboximetilo (CM)

    20. Principios del intercambio iónico La afinidad de una proteína es proporcional a la concentración de sal requerida para liberarla del material. Una columna se carga (de proteínas) con un amortiguador de baja fuerza iónica y la elusión se inicia por incremento de la concentración del amortiguador de elusión.

    21. Desarrollo de una cromatografía de intercambio iónico Hidratación y Lavado de la resina Activación (lavado con ácido y base fuerte diluidos, HCl 1M seguido de NaOH 1M y finalmente con la sal que se usará ej. NaCl 1M y equilibrar con buffer sin sal) Volumen de la columna y capacidad de retención de la resina.

    22. Diferentes sales tienen diferentes fuerzas de elución cuando se usan en cromatografía de intercambio iónico. Intercambio del anión citrato>sulfato>oxalato>I->NO3-2>CrO4->Br- > SCN- > Cl- > Formiato Intercambio del catión Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd > Cu > Co > Zn>Mg>Ti+> Ag > Rb+>Cs+>K+>NH4+>Na+>H+>Li+

    23. Amortiguadores Para intercambiadores aniónicos se deben usar amortiguadores catiónicos o zwitterionicos No usar amortiguadores aniónicos pues se unen a la resina. Usar detergentes catiónicos o no iónicos.

    24. Cromatograma de intercambio iónico

    25. Hidroxiapatita (HA) Introducida por Tiselius et al. en 1956 Bernardi realizó un estudio sistemático (Meth. In Enzimol. Vol. 22 y 27)

    26. Fórmula Forma cristalizada de fosfato de calcio (Ca10(PO4)6(OH)2)

    27. Unión selectiva de proteínas a la hidroxiapatita A, es una proteína básica. B, es una proteína acídica El triángulo indica enlaces de coordinación. Los dobles paréntesis indican repulsión. Las líneas punteadas indican enlaces iónicos.

    28. Adsorción de grupos amino Se debe a interacción electrostática no específica entre su cargas positivas y las cargas generales negativas de la columna de HA cuando la columna es equilibrada con amortiguador de fosfato.

    29. Incremento de la unión de aminas por bloqueo de la repulsión. A, es una proteína básica. B, es una proteína acídica El triángulo indica enlaces de coordinación. Los dobles paréntesis indican repulsión. Las líneas punteadas indican enlaces iónicos.

    30. Disociación selectiva de la hidroxiapatita A, es una proteína básica. B, es una proteína acídica El triángulo indica enlaces de coordinación. Notar que estos no se afectan.

    31. Efecto de la concentración de fosfato en la unión de proteínas El perfil superior fue cargado con fosfato 1 mM El inferior, con fosfato 50 mM. La capacidad de unión de las IgG se mejoró reduciendo la competencia de contaminantes.

    32. Barrido con dos gradientes El primer gradiente va de 0 a 500 mM de cloruro de sodio. El segundo, de 0 a 500 mM de fosfato de potasio. El amortiguador base es 0.5 M MES, 1mM fosfato, pH 6. La elusión de la IgG se observa en gris

    33. Usos Purificación de: Proteínas Ácidos nucléicos Virus

    34. Bases de la Técnica Su selectividad no depende de la masa molecular, densidad de carga o punto isoeléctrico.

    35. Bases de la técnica La adsorción y la elución de las proteínas no son procesos en reversa de un solo efecto. Los grupos amino y carboxilo actúan de manera diferente en la adsorción de las proteínas a la HA. La elución de proteínas ácidas y básicas por diferentes sales tiene deferentes mecanismos.

    36. Ventajas HA tiene poco poder de adsorción de moléculas de masa molecular baja como nucleótidos, sales y aminoácidos. Es relativamente incompresible. Existen variantes cerámicas más fáciles de trabajar pues no se compactan.

    37. Cromatografía hidrofóbica

    38. Cromatografía Hidrofóbica Los grupos adicionados al soporte son el alcohol octílico, grupos bencénicos u otros grupos hidrófobos como hidrocarburos (C4, C8 o C18). Los centros hidrófobos de las proteínas son expuestos por exceso de salinidad y son atrapados por la columna.

    39. Cromatograma hidrofóbico

    40. Series caotrópicas Aniones PO4–>SO4–>CH3COO–>CL–>Br–>NO3–>ClO4–>I>SCN– Cationes NH4+>Rb+>K>Na+>Cs+>Li+>Mg>Ca2+>Ba2+

    41. Cromatografía de Afinidad Sistema muy poderoso de purificación Sistema restringido Se basa en la interacción específica de dos compuestos Antígeno - Anticuerpo Enzima - sustrato Receptor - Ligando

    43. HPLC Cromatografía líquida de alta resolución High-performance liquid chromatography

    44. Limitaciones de la cromatografía a bajas presiones Imposibilidad física de aumentar el flujo Resinas compresibles Corridas de muchas horas Grandes volúmenes

    45. Descubrimientos que facilitaron la HPLC Síntesis de resinas incompresibles Nuevas técnicas en el empaque de las columnas Microparticulación de las resinas Adelantos en la tecnología espectrofotometrica

    46. Tipos de HPLC De exclusión molecular Intercambio iónico Hidrofóbica Afinidad De fase reversa

    47. Instrumentación Sistema de bombeo Resistente a químicos Poca variabilidad Presiones de 30 as 400 atm Flujo constante (libre de pulsos) Buen mezclado de los solventes Reproducibilidad en la formación de los gradientes

    48. Tipos de bombas Jeringa Pistón recíproco Diafragma Presión constante

    49. Detectores Detectores de UV-Visible que pueda leer 2 o más longitudes de onda al mismo tiempo Detector de arreglo de diodos. Espectro de 200 a 600 nm en menos de 1 segundo.

    50. Cromatografía de fase reversa Se basa en las propiedades hidrofóbicas de las proteínas. El proceso de elución es diferente que en la cromatografía hidrofóbica La fase móvil es un solvente orgánico (metanol, 2-propanol o acetonitrilo) acidificado (TFA, ácido fosfórico, acético o hidroxibutírico).

    51. Fase estacionaria Sílica acoplada con un derivado alquilsilano. La longitud de la cadena alquilo puede ser de C4, C8, C18. La porosidad del soporte es variable y se recomienda que sea entre 300 a 1000 A El tamaño de las partículas es de 5 a 20 µm

    52. Fase móvil La acidez de la fase móvil: Influencia el estado iónico de la proteína Controla la ionización de la superficie silanol Forma pares iónicos con la zona catiónica de la proteína Favorece la exposición de zonas hidrofóbicas de la proteína

    53. Cromatograma de fase reversa

    54. HPLC de Fase Reversa Separación eficiente aún con concentraciones altas de proteínas Bajo ruido de fondo Solventes volátiles Fácil formulación de la fase móvil Reproducibilidad de gradientes.

    55. Diagrama del sistema HPLC

    57. HPLC WATERS

    62. Cromatógrafo de Gases

    63. Principales componentes Gas de acarreo Controladores de flujo Inyectores Columnas Detectores Sistema de datos

    64. Con ciertos tipos de columnas y detectores, se requiere el uso de un gas de complemento en el detector (“make-up”). El “make-up”, es un gas de arrastre adicionado al efluente de la columna antes de que pase al detector. El sistema del gas portador, por lo general contiene uno o varios tamices con el objeto de eliminar humedad, hidrocarburos y oxígeno. Los caudales utilizados en las columnas empacadas oscila entre 25 y 90 mL/min y de 1 a 2 mL/min en las capilares. Gas de acarreo

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