Dýchací řetězce

1. Dýchací řetězce 4.ročník biochemie

2. Téma * Dýchací řetězce MTCH a baktérií * DŘ Mtch více než 20 přenašečů e- * multipeptidové komplexy I, III, IV * známa sekvence a struktura * DŘ patří mezi transportní řetězce elektronů - další: fotorespirace, detoxifikace, syntézy - lineární řetězce v membránách - až 80 Å !!

3. Komponenty DŘ Přenos e- NAD+/NADH na 02/H20 - rozsah redox potenciálu 1,1 V - reverzibilita reakcí – obecně Eh Em Dehydrogenasy s Em 0 mV TD vyloučena redukce NAD+ sukcinát DH s,n-glycerolfosfát DH ETF-ubichinone oxidoreduktasa - přenos e- do DŘ při potenciálu blízkém 0 mV - vyžaduje vazbu na membrány Proč „komplexy“ – rozpad membrán při použití detergentu - někdy komplex V = ATP syntáza - rekonstituční experimenty

4. Dehydrogenasy

5. Sulfit oxidasa

6. Komponenty DŘ • Flavoproteiny – prostetická skupina FAD, FMN (2H+, 2e-) • 2) Cytochromy – porfyrin (1e-) • 3) Fe-S proteiny – nehemové železo (1e-) • 4) Ubichinone („koenzym Q“ ) – volný, rozp. v tucích (2H+, 2e-) • 5) Proteinově vázaná měď – Cu 2+ / Cu+

7. Klasifikace cytochromů Cytochromy – podle porfyrinové složky Cyt b – jako Hb Cyt c – hem kovalentně vázán 2 Cys skupinami Cyt a – modifikace cyt b a) farnesylová (C15) skupina místo vinylové b) metyl na C8 nahrazen formylovým zbytkem Bakteriální cytochromy: celé řada typů cyt d, d1 cyt o – něco mezi cyt a a cyt b (má farnesyl x nemá formyl)

8. Mechanismus přenosu elektronů • Přenos e- na vzdálenost až 14 Å ~ „tunelování“ • - Kvantová mechanika: určitá pravděpodobnost průchodu vlnové částice energetickou bariérou • * důkaz = necitlivost přenosu e- v DŘ na teplotě • Faktory ovlivňující rychlost přenosu v DŘ: • Vzdálenost mezi donorovým a akceptorovým centrem • snadné pro atomy x obtížně definovatelné pro hem • b) Rozdíl G (redox potenciálů) mezi donorem a akceptorem • c) „reorganizační energie“ – odpověd donoru, akceptoru a prostředí na změny v rozmístění náboje

9. Vliv vzdálenosti center Pro jednotlivé kroky přenosu – obvyklá hnací síla ~ 100mV * vzdálenost 3 Å … rychlost 1010 s-1 10 Å .. rychlost 107 s-1 14 Å …rychlost 10-4 s-1 * pro vzdálenost větší než 14 Å … řádově hodiny * změna konformace a tedy vzdálenosti = regulace toku e- * správná vzdálenost = správný akceptor

10. Přenos e- v redoxních centrech Rhodopseudomonas viridis endergonní exergonní P

11. Přechodné interakce proteinů v DŘ Podmínka pro přechodné interakce a přenos e-: - vzdálenost redoxních center < 14 Å (tj. musí být umístěny relativně na povrchu) * Příklad: cytochrom c – rychlá laterální difúze v membráně 1) hemová skupina cca 5 Å vzdálenou od povrchu 2) blízkost skupiny Lys (13,86,87) – interakce s partnery 3) hem izolován proteinem cca 30 Å cytochrom c oxidasa - CuA centrum blízko povrchu - nabité skupiny pro interakci se skupinou Lys na cytochromu c

12. Mechanismus translokace protonů • Smyčka (loop) – řada alternujících přenašečů e- a H+ • * původní koncept chemiosmotické teorie • * přenos náboje dosažen spíše přenosem e- než H+ • * funguje u MTCH i bakteriálních systémech • 2) Pumpa (pump) – přímý přenos H+ přenašečovými proteiny • * redoxní reakce spojená se změnou konformace proteinu • * není limitován stechiometrií H+/e- • * komplex IV, bakteriorhodopsin • Celková energetika je shodná • Některé systémy fungují spojením obou mechanismů

13. Příspěvek H+ k přenosu náboje záleží na hloubce uložení BH2 v membráně Translokace H+ smyčkou Hlavní příspěvek k přenosu náboje je pohyb e- pro redukci C

14. Translokace H+ pumpou Přenosu náboje je uskutečňován pouze přenosem H+

15. Model „konformační“ pumpy P příklad: bakteriorhodopsin

16. Komplex I (NADH-UQ oxidoreduktasa) • „Nejméně“ vyjasněná část DŘ • Velikost (43 podjednotek, 750kDa ~ velká podjednotka ribozómu) • Fe-S centra (vyžadují techniku EPR při nízkých teplotách) • Aktuální poznatky: • stechiometrie 4H+/2e- • modely ze sekvencí bakteriálních proteinů (E.coli – 13 podjednotek) • tvar L (elektronová mikroskopie) – závislý na iontové síle roztoku • další enzymové funkce (přenašeč acylu, hydroxysteroid reduktasa) • Fe-S centra v „spojovací“ části nedetekována EPR – párování spinů

17. Struktura komplexu I Translokace protonů NuoI ? „hydrofóbní frakce“ inhibitor označení genů z bakteriálního operonu „flavoproteinová frakce“

18. Transport e- bez translokace H+ • Další 3 enzymy dodávající e- na UQ: • 1) Sukcinátdehydrogenasa (komplex II) – napojení TCA cyklus • * jediný membránově vázaný • 2) ETF – ubichinonoxidoreduktasa • (electron-transferring flavoprotein-ubiquinone oxidoreductase) • * na straně matrix MTCH membrány • 3) s,n-glycerolfosfátdehydrogenasa • * pouze v některých MTCH vázán na vnější straně membrány • * funkčně velmi významný v živočišných buňkách • všechny Em,7 ~ 0 mV • neúčastní se translokace H+

19. Sukcinát dehydrogenasa (komplex II) • SDH - 4 proteinové podjednotky s funkční rolí • - nejvzdálenější od membrány – kovalentně vázaný FAD • - periferální podjednotka – 3 Fe-S centra • - 2 membránová podjednotky – 1 hem v „sendviči“ podjednotek • redukce sukcinátu - celkový přenos náboje nulový • spotřeba p přenosem H+ z P-fáze pro redukci chinonu v membráně

20. Sukcinátdehydrogenasa (komplex II) - modely na základě bakteriální fumarátreduktasy (obrácená reakce) B. subtilis - přenos e- na menachinon MTCH hem hem

21. Transport e- bez translokace H+ • 2) ETF – ubichinonoxidoreduktasa • - v matrix, obsahuje FAD, Fe-S centrum a vazebné místo UQ • - akceptuje e- z několika flavinových dehydrogenas: • katabolismus FA, AA, cholinu • - povrch je schopen „ponořit se“ do membrány • 3) s,n-glycerolfosfátdehydrogenasa • - P-strana vnitřní MTCH membrány • - obsahuje 1 FAD, nejméně 1 Fe-S centrum • - v genomu mnoha organismů od kvasinek po člověka • x různé role v bioenergetice podle typu buněk

22. Ubichinone a komplex III (bc1) • Přenos e- z ubichinolu na cytochrome c: • - komplex III (bc1, UQ-cytochrome c oxidoreduktasa) • Redoxní centra: • Rieskeho protein – 2 Fe-S centra (chelace Cys a His) • Podjednotka s 2 hemy b - • Cytochrom c1 – 1 hem • Globulární polypetidy s hydrofóbní membránovou kotvou • Cytochrome c1 má 8 transmembránových -helixů

23. Struktura Fe-S center • Fe-S centrum se 4 labilními atomy síry • (pouze 1e- redukce) b) Rieskeho protein: 2 komplexy Fe-S s dvěma His a 2 Cys ligandy

24. Krok 1: oxidace UQH2 na radikál UQ.- Redox potenciály Em,7: pár UQH2/UQ: vodný roztok +60mV x aktuální Eh,7 ~ 0mV pár UQH2 /UQ.- +280mV pár UQ.-/UQ -160mV Probíhá na vazebném místě Qp – blízko P-straně a Rieskeho komplexu * tvorba radikálu 1e- redukcí energeticky výhodná * radikál stabilní – lze detekovat EPR * za určitých podmínek přímá reakce s O2 - superoxid

25. Krok 2: redukce UQ na radikál UQ.- • Přenos e- mezi hemy: • hem bL -100mV • hem bH+50mV x ale pár UQ.-/UQ -160mV ? • Poloha hemů – na opačné straně membrány s  = 150mV • Elektrony při přechodu neztrácejí původní energii (x rozpojené mitochondrie – dissipace) • Vazebné místo Qn – vysoká afinita k radikálu ve srovnání s UQ • * TD umožnuje průběh reakce – 300x násobný rozdíl ve vazebné energii posunuje aktuální redox potenciál UQ.-/UQ do pozitivnější hodnoty

26. Případ pro vazebné místo na N-straně volné nebo obsazené ubichinonem Q-cyklus v MTCH

27. Případ pro vazebné místo na N-straně obsazené ubisemichinonovým radikálem Q-cyklus v MTCH Qp – vazebné místo pro UQ Přenos 1 e- na Rieske p. Přenos 1 e- na bL hem Semichinonový radikál

28. Pohyb globulární domény v ISP

29. Pokračování příště …