药物代谢动力学实验技术简介

1. 药物代谢动力学实验技术简介 缪明星 中国药科大学药学医学基础实验中心

2. 实验安排 • 1.HPLC原理与标准操作规程(SOP) • 2.实验设计与动物实验 • 3.样品处理与方法开发 • 4.定性定量与分析测定 • 5.数据处理与药动学参数计算 • 6.实验报告

3. High Performance Liquid Chromatography HPLC 的组成 • Pump 泵 • Injector/Autosampler 进样器/自动进样器 • Column 色谱柱 • Detector 检测器 • Data System/Integrator 数据系统/积分仪表

4. 高效液相色谱系统

5. 分配色谱的分离机理

6. 分配色谱概述 • 反相色谱的主要类型，基于分子的极性分离 • 洗脱次序：一般为反相，即极性高的先被洗脱 • 常用的流动相： • 有机溶剂如甲醇、乙腈，水 • 应用添加剂，成为离子对、离子抑制方法 • 常用固定相： • 碳十八、碳八、胺基等基团 • 反相色谱固定相多为键合相

7. 对HPLC柱的了解 • 色谱柱分类 • 填料，含碳量，基质，粒径 • 色谱柱的应用 • 正相柱，反相柱，预处理柱 • 色谱柱的规格 • 内径，长度

8. 键合相色谱柱 • 以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上，作为固定相。 • 优点∶ • 固定相稳定，不易流失 • 应用广泛，可使用多种溶剂 • 消除硅羟基的不良影响 • 缺点∶ • pH值不能小于3 • 同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同

9. 反相C18色谱柱的活化 • 步骤一： • 90%甲醇1mL/min流速冲洗30min • 步骤二： • 10%甲醇1mL/min流速冲洗30min • 步骤三： • 90%甲醇1mL/min流速冲洗60min

10. 色谱柱的存放 • 存放前的处理 • 除去杂质、盐  • 合适的存放溶剂 • 避免色谱柱床的干枯 • 避免机械震动 • 防止细菌生长 • 注意存放的温度

11. 液相色谱对流动相的要求 • 除色谱柱对流动相对的要求外，还有∶ • 与检测器匹配 • 脱气 • 避免卤素离子（不锈钢系统） • 溶剂的粘度 • 细菌的生长

12. 流动相的脱气 • 流动相脱气的目的 • 使色谱泵的输液准确 • 输液均匀准确，并且脉动减小 • 保留时间及色谱峰面积的重现性提高 • 提高检测的性能 • 防止气泡引起的尖峰 • 基线稳定，信噪比增加 • 溶剂的紫外吸收本底降低 • 保护色谱柱 • 减少死体积 • 防止填料的氧化

13. 流动相脱气的方法 • 加热 • 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化 • 抽真空 • 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果 • 超声波 • 简单，但效果不理想。 • 通惰性气体（一般用氦气） • 可保持连续脱气，多用于低压梯度 • 脱气机 • 可保持连续脱气，多用于低压梯度

14. 色谱峰定性 • 鉴别每个色谱峰 • 通过比较保留值(通常是保留时间)的方法，找到各色谱峰所对应的组份 • 大多数情况下用比较保留时间来定性 即所谓： • 保留时间相同，可能是同样的组份 • 保留时间不同，肯定不是同样的组份

15. 用保留时间定性 • 用“标样”的保留值定出被测组份的位置

16. 标准加入法举例 • 废水样品中五氯苯（PCP）的分析 4 ppm 3 ppm 2 ppm PCP 1 ppm

17. 常用的定量方法 • 峰面积百分比法 • 由于检测技术的影响，在液相色谱中不常用 • 外标法 • 在液相色谱中用的最多 • 内标法 • 准确，但是麻烦 • 在标准方法中用的最多

18. 外标法定量 • 配制一系列已知浓度的标样

19. 外标法定量（二） • 实际色谱图 标准曲线

20. 内标法定量（一） • 配制一系列浓度的标样，其中加有内标样

21. 内标法定量（二） • 实际色谱图 标准曲线

22. 内标法定量（三） • 对内标物的要求 • 化学结构与待测组分相似(同系物、异构体) • 在样品中不存在 • 不与样品中组份发生任何化学反应 • 保留值与待测组分接近 • 浓度（响应值）与待测组分相当 • 其色谱峰与其他色谱峰分离好

23. 可接收的检测范围 • 校正曲线只有在建立这条曲线的浓度范围内有效，高或低于这些点都可能引起计算错误

24. 样品的预处理 • 样品预处理的目的 • 除去微粒 • 减少干扰杂质 • 浓缩微量的组份 • 提高检测的灵敏度及选择性 • 改善分离的效果 • 有利于色谱柱及仪器的保护

25. 样品的预处理重要性 • 占样品分析时间的比例 • 样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 • 占分析的消耗总成本最大 • 消耗大量的溶剂及其他化学品 • 实验的重复性及准确性最差的环节 • 影响实验结果好坏的最重要因素 • 是决定性的步骤

26. 样品预处理常用的方法 • 高速离心 • 过滤、超滤 • 选择性沉淀 • 衍生反应 • 液-固萃取 / 液-液萃取 • Sep-Pak样品处理小柱 • 其他

27. 选择性沉淀 • 常用于生化样品中除蛋白 • 有机溶剂 • 乙腈，甲醇 • 强酸 • 三氯乙酸，过氯酸 • 盐 • 50% 硫酸铵 • 10% TCA

28. 样品分析时第一步干什么? • 想办法得到各种信息 • 向同行了解是否做过此类样品，或有否类似样品的分析方法 • 查文献，如CA(化学文摘) • 仪器制造商的文献，如Waters • 对色谱柱有足够的了解 • 掌握分离机理，自己开发方法 • 充分了解您自己的样品

29. 分析时要了解哪方面的情况？ • 灵敏度的要求有多高? • 样品的本底是否很复杂? • 有多少组份要分析? • 对分析的精确度、准确度等有多高要求? • 是否因是日常检验，而要求方法容易使用?

30. 使用文献方法 • 色谱柱填料的种类、品牌是否相同? • 注意文献方法的流动相 • 是否损害色谱柱? • 如色谱填料品牌不同，需要调整流动相 • 注意色谱柱的规格：内径、柱长 • 需要调整流速、进样量 • 注意梯度条件 • 了解系统的滞后体积（梯度）

31. 反相色谱的方法开发 • 开发过程实例 • 色谱条件∶ • 色谱柱：C18，4mm×30mm • 流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱 • 流速：2ml/min • 样品： ① 对羟基苯甲酸甲酯(Methyl Paraben) ② 对羟基苯甲酸丙酯(Propyl Paraben) ③ 对羟基苯甲酸丁酯(Butyl Paraben)

32. 改变流动相比例 谱图

33. 改变流动相组成 • 通过改变流动相改变选择性 • 同样强度的不同溶剂 • 改变色谱柱

34. 离子型化合物的分离方式 • 使用离子交换柱∶离子交换法 • 主要用于“强”阴、阳离子 • 使用反相柱 • 离子抑制色谱法 • 通过改变流动相的pH值，使样品成中性 • 离子对色谱法 • 加入“对离子”，使样品呈中性

35. 离子抑制色谱 • 离子型化合物在反相色谱柱上不保留 • 改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离 • 适用于弱酸性化合物的分离 • 降低流动相的pH值，使样品降低离子化 • 使用硅胶基质C18填料 • 使用条件应在填料基质的范围内 • 硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）内

36. 常用缓冲液及其pH值

37. 离子抑制色谱实例 • 在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。

38. 其他精密仪器操作标准操作规程(SOP)要点 高速冷冻离心机：配平、十字交叉、样品选择 普通离心机：配平、十字交叉、样品选择 万分之一电子天平：称量量程范围、记录、保养 紫外可见光分光光度计：预热、样品量、校准 涡旋振荡器：涡旋程度 超声机：超声效果、时间

39. 药代动力学实验室的要求 1.环境的要求：灰尘、湿度、阳光是分析仪器的大敌 2.所写即所做 3.分析测定用试剂为色谱纯及以上，水为超纯水 4.痕量分析对实验人员有较高要求 5.对仪器设备的操作严格按照SOP执行，专人管理和 维护保养 6.良好的实验习惯