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专题二： 胚胎干细胞的获取 与生物特性

专题二： 胚胎干细胞的获取 与生物特性. 一、胚胎干细胞研究历程. 1 、 Stevens （ 1958 ） 胚胎瘤细胞 （ EC 细胞） 2 、 Evans 等（ 1981 ）、 Martin （ 1981 ） 小鼠 ES 细胞系 3 、 1992 ， Matsui 等（ 1992 ）和 Resnick 等（ 1992 ） EG 细胞系系

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专题二： 胚胎干细胞的获取 与生物特性

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Presentation Transcript

  1. 专题二： 胚胎干细胞的获取 与生物特性

  2. 一、胚胎干细胞研究历程 1、Stevens（1958） 胚胎瘤细胞 （EC细胞） 2、Evans等（1981）、Martin（1981） 小鼠ES细胞系 3、1992，Matsui等（1992）和Resnick等（1992） EG细胞系系 4、Thomson等（1998）和Shamblott （1998） 人类ES细胞系和EG细胞 5、ES细胞定向分化为心肌细胞、血细胞、神经细胞、胰岛细胞、生殖细胞 等重要功能性细胞（1999-2004）。 6、体细胞克隆胚胎源的人类ES细胞系的建立（Hwang 等,2004）——因为造假 而否定。

  3. 二、关于胚胎干细胞系的说明 细胞系的概念（Cell Line) 取自动物或人体并置于体外培养中生长的细胞在其传代前称为原代培养或原代细胞。当细胞持续生长增殖一段时间，达到一定的密度后，就应当将细胞分离转至新的培养皿并补充新的培养液，这称为传代。传代生长以后就称为细胞系。细胞系可分为有限细胞系和无限细胞系。有限细胞系的寿命只能维持一定的时间期限，最后，细胞增殖缓慢，进而发生衰退、死亡。无限细胞系是获得不死性而具有持久或无限增殖能力的一种细胞系。无限细胞系的建立与细胞的种族、来源及性质有关。

  4. ES细胞系 (Embryonic Stem Cell Line) 真正意义上的ES细胞系是： 要能形成具有种系传递能力的生殖系嵌合体。目前，只有小鼠才可以称作是建立真正意义上的ES细胞系。 在人上 ，由于伦理问题不可能来制作嵌合体，因此，只能称作一般意义上的ES细胞系。

  5. 一般意义上的ES细胞系应具备以下标准： ① 能稳定传代，并且有大量未分化的细胞。 ② ES细胞检测方法检测具有多能性。 ③ 能反复冷冻、解冻而不失多能性。 ④ ES细胞遗传背景明了，来源清楚。 ⑤ 无细菌、病毒、支原体及其它病原体污染。

  6. 三、胚胎干细胞来源 1．体内体外发育的早期胚胎 • 它是建立ES细胞系的主要途径，绝大多数的ES细胞系都是通过该途径建立的。 • 通常取3.5-4日龄囊胚（Blastocyst），通过全胚培养、免疫外科或机械分离等方法，或两种、三种方法结合分离内细胞团(Inner cell mass ICM)，反复传代从而建立ES细胞系。Evans等（1981）、Kaufman等（1983）报道利用延迟着床囊胚建立mES细胞系。 • 桑椹胚、8-细胞胚胎 等早期胚胎。

  7. 通过体细胞核移植建立ES细胞系 • 1996年克隆羊“多利”的诞生，证明终末分化的体细胞核具有发育上的全能性，通过核移植途径建立ES细胞系是一条现实可行的途径。 • Munsie等（2000）、Kawase等（2000）、 Hochedlinger等（2002）分别以小鼠颗粒细胞、胎儿神经细胞、外周血淋巴细胞作为供核细胞，成功地建立了核移植mES细胞系。但目前建系成功率较低，一般不超过5%。Hwang 等（2004）报道建立了核移植的人类ES细胞系。 • 异种核移植是建立ES细胞系的另一途径。 陈颖等（2003）将人成纤维细胞注入成熟的兔去核卵母细胞，建立了核移植人类ES细胞系。

  8. 3、 利用孤雌胚胎建立ES细胞 • 分离孤雌囊胚ICM可建立ES细胞系。Robertson等（1983）、Lin等（2003）利用孤雌胚胎建立ES细胞系不用毁坏受精胚胎，可避免毁坏受精胚胎所带来的伦理学上争议，目前已建立了孤雌胚源非人灵长类猴子的ES细胞系 。

  9. 4、自原始生殖细胞克隆转化而来的胚胎干细胞4、自原始生殖细胞克隆转化而来的胚胎干细胞 从受精后8.5-12.5日龄小鼠胚胎背、肠系膜和/或生殖嵴分离PGCs，结果显示PGCs在集落形态、生长特性、细胞表面标志、分化潜能与ES细胞类似，具有形成功能性配子和实现种系嵌合的能力，为与附植前胚胎来源的ES细胞相区别，现称其为胚胎生殖细胞（Embryonic germ cells EGC）， • Matsui Y等（1992）首次报道建立PGCs来源的小鼠多潜能干细胞系，国内许新等 • （1999）报道建立PGCs来源的小鼠多潜能干细胞系。 5 其他来源 • 羊水细胞、上胚层细胞、性腺………？

  10. 四 、胚胎干细胞的分离培养方法和关键技术环节

  11. 1. 早期胚胎的获取处理 目前，小鼠多取3.5d囊胚，猪取9-10d囊胚；兔取3.5-4d囊胚，绵羊取8-9d囊胚，牛取6-7d桑椹胚或7-8d囊胚，人取5-8d囊胚。为了提高ES细胞分离克隆的效率，可对早期胚胎进行延迟胚胎着床。 分离ICM（免疫外科法、组织培养法或机械剥离法）、脱带处理、热休克处理离散卵裂球等方法进行处理后将胚胎或ICM接种培养在含饲养层的培养液中。

  12. Embryonic Stem Cell Isolation remove zona pellucida from blastocyst Blastocyst Outgrowth Microsurgery Immunosurgery antibody binding pipet off ICM cut TE complement TE cells lyse trypsinize dissect off ICM trypsinize plate on feeder cell layer

  13. 2 ES细胞的分化抑制培养 ES细胞的培养，既要促使其能迅速增殖，又要不分化，保持其全能性。而一般增殖和分化几乎同时进行，这就需要很好的解决抑制分化和增殖这一对矛盾，ES细胞的分离与获取需同时满足抑制分化和促进增殖两个条件。 A 干细胞培养的基础培养基 DMEM、血清10%~20、非必需氨基酸、核苷酸、 2-巯基乙醇、亚硒酸钠、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。 B 分化抑制物 饲养层（细胞）、条件培养基、分化移植因子 C 抗凋亡剂

  14. 附：关于饲养层和条件培养基的说明 饲养层是将所选用的细胞（如胎儿成纤维细胞，输卵管上皮细胞，子宫上皮细胞、STO细胞，大鼠肝细胞，睾丸细胞等）用丝裂霉素C或r射线阻断其有丝分裂活性后制成的细胞单层。 研究表明，饲养层细胞可合成并分泌成纤维细胞因子（FGF）等促有丝分裂因子和白血病抑制因子等细胞分化抑制因子，这些细胞因子通过与ES细胞表面受体的结合而发挥抑制细胞分化的作用。

  15. 条件培养基 即将合适的细胞（STO、PMEF、BRL、T3、PSA-1等）培养一定时间后收集细胞培养液，经离心透析冷冻后重新制成溶液，过滤后作为贮备液，用于ES细胞分离培养。 条件培养基通过培养细胞分泌到培养基中的生长因子，刺激ES细胞增殖同时抑制其分化而发挥作用

  16. 3 ES细胞的克隆扩增

  17. 4 ES细胞的冷冻与解冻 ES细胞的冷冻与解冻与其它细胞基本一致，常用的冷冻培养基含5－10%DMSO+10-90％血清的DMEM培养液。具体操作程序参照Robertson E. Teratocarinomas and embryonic stem cells: a practical approach. IRL Press. 1987。

  18. 五、胚胎干细胞的生物学特性与鉴定 1 ES细胞的形态特征和生长特性 各种ES细胞都具有基本相似的形态结构特征，即胞体体积小，核大，有一个或多个核仁。ES细胞呈集落生长，细胞界限不清，ES细胞具有连续无限地保持未分化状态传代的能力。

  19. 2ES细胞的核型 • ES细胞具有稳定正常整倍体核型。小鼠、人等ES细胞长期传代后均能保持正常二 • 倍体核型。这是ES细胞较EC细胞和体细胞的一大优点。

  20. 3 ES细胞表达的酶，细胞表面抗原和受体

  21. 4 高度的分化潜能－三胚层的分化潜能： 体外分化实验、体内分化实验即畸胎瘤实验、定向分化实验 、嵌合体实验 （1）体内分化潜能。将ES细胞注射于同源动物或SCID小鼠则形成复杂的混合组织瘤。取瘤作组织切片观察，一般可见到三个胚层的不同组织细胞。小鼠、猪、牛、人ES细胞均具有体内分化潜能。 （2）体外分化潜能。ES细胞在悬浮培养或在视黄酸等分化诱导剂或聚集堆叠培养时，会自发分化，形成神经、血液细胞、软骨、心肌、上皮细胞等组织细胞类型，部分形成类胚体（含有三个胚层的不同细胞）。 （3）嵌合体试验。嵌合体试验是验证ES细胞全能性的最稳定实验，即ES细胞与正常胚胎嵌合，如能产生包括生殖系在内的各个组织器官且能产生功能性配子的嵌合体（种系嵌合体）个体，即可证实的确分离到具发育全能性的ES细胞系。目前仅自小鼠ES细胞系得到生殖系（种系）嵌合体。 （4）核移植。用ES细胞作核供体进行核移植可获得克隆后代，Wakaynma等（1999）自小鼠ES细胞核移植得到克隆小鼠[150]。Campell(1996)和trelchenko(1998)等分别得到类ES细胞核移植绵羊、牛。

  22. 体内分化实验

  23. Transgenic (carries foreign DNA; may or may not be mosaic; two parents) Mosaic (may or may not carry foreign DNA; two parents) Chimeric (may or may not carry foreign DNA; more than two parents) Terminology

  24. Mosaic vs Chimeric Progeny Mosaic Chimeric

  25. Chimera Production Blastocyst Injection Aggregation Flush embryos Uterus E3.5 Oviduct E2.5 Morula Blastocyst ES cells Remove zona pellucida Darning needle aggregation Recover 1-2 hours culture overnight implant into pseudopregnant surrogate mother

  26. Coat Color Chimeras

  27. 5 ES细胞的端粒酶活性 • Thomson等首次研究表明人ES细胞（hES细胞）高度表达端粒酶活性，其它动物ES细胞是否高表达端粒酶活性有待进一步研究。

  28. 7　冷冻保存 　　　小鼠ＥＳ细胞冷冻保存成熟，人类ＥＳ细胞冷冻保存有待提高． 8　动物模型治疗实验实验 （详细见下周录像）

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