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第四章. 发酵工业的无菌技术. 本章内容. 一、 概念 二、 发酵工业污染的防治策略 三、 发酵工业的无菌技术 四、 培养基及设备灭菌 五、 空气除菌. 一、概念 : 灭菌、消毒、除菌、 防腐. 灭菌 (sterilization): 用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。 消毒 (disinfection): 用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌 (degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐 ( antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖 。
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第四章 发酵工业的无菌技术
本章内容 一、概念 二、发酵工业污染的防治策略 三、发酵工业的无菌技术 四、培养基及设备灭菌 五、空气除菌
一、概念:灭菌、消毒、除菌、防腐 灭菌(sterilization):用化学或物理方法杀死物料或设备中所有有生命物质的过程。 消毒(disinfection):用物理或化学方法杀死空气、地表以及容器和器具表面的微生物。 除菌(degermation): 用过滤方法除去空气或液体中的微生物及其孢子。 防腐(antisepsis): 用物理或化学方法杀死或抑制微生物的生长和繁殖。 • 消毒与灭菌的区别 • 消毒与灭菌在发酵工业中的应用
二、发酵工业污染的防治策略 （一）污染的危害 （二）污染的防治
1.染菌的不良后果 • 消耗营养 • 合成新产物；菌体自溶、发粘等造成分离困难 • 改变pH • 分解产物 • 噬菌体破坏极大
2.染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响2.染菌危害的具体分析（1）染菌对不同菌种发酵的影响 A．细菌 • 谷氨酸：发酵周期短，培养基不太丰富，较少染杂菌，但噬菌体威胁大。 • 肌苷：缺陷型生产菌，培养基丰富，易染菌，营养成分迅速被消耗，严重抑制菌生长和合成代谢产物。
（1）染菌对不同菌种发酵的影响 B. 霉菌 • PenG：青霉素水解酶上升，PenG迅速破坏，发酵一无所获。 • 柠檬酸：pH2.0，不易染菌，主要防止前期染菌。 C. 酵母菌: 易污染细菌以及野生酵母菌 D. 疫苗：无论污染的是活菌、死菌或内外毒素，都应全部废弃。
（2）染菌种类对发酵的影响 • 青霉素：怕染细短产气杆菌 • 链霉素：怕染细短杆菌、假单孢杆菌和产气杆菌 • 四环素：怕染双球菌、芽孢杆菌和荚膜杆菌 • 柠檬酸：怕染青霉菌 • 肌苷（酸）：怕染芽孢杆菌 • 谷氨酸：怕染噬菌体，易造成连续污染
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响 灭菌后弃去 • 种子扩大时期染菌: • 发酵前期染菌： • 发酵中期染菌：挽救困难，应早发现，快处理 ，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定 • 抗生素发酵 • 柠檬酸发酵 a. 污染细菌：加大通风，加速产酸，调pH3.0，抑制细菌 b. 污染酵母：加入0.025~0.035g/L CuSO4抑制酵母；通风加大，加速产酸。 应迅速重新灭菌，补充必要的营养成分，重新接种
（3）不同发酵时期染菌对发酵的影响 • 柠檬酸发酵 c.染黄曲霉：加入另一罐将近发酵成熟的醪液，pH下降，黄曲霉自溶。 d.青霉菌：在pH很低下能够生长。提前放罐。 • 发酵后期污染 • 染菌量不太多，可继续发酵 • 污染严重，则提前放罐 杀菌剂的添加：前期无必要，增加成本； 发现后加入，效果要具体评价
（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响（4）杂菌污染对发酵产物提取和产品质量的影响 • 丝状菌发酵被产酸菌污染：pH不断下降，菌丝大量自溶，发酵液粘度增加，过滤困难 处理方法：①将发酵液加热后再加助滤剂；②先加絮凝剂使蛋白质凝聚后沉淀 • 杂菌分泌较多蛋白质杂质时，对发酵后处理过程中采用溶媒萃取的提取工艺非常不利，使水相和溶媒之间极易发生乳化
1. 染菌的检查与判断 • 显微镜检查法 镜检出杂菌需要一定时间 • 平板划线培养或斜面培养检查法：菌落 噬菌体检查可采用双层平板法：噬菌斑 • 肉汤培养检查法 • 发酵过程的异常现象判断 • DO2水平异常变化 • pH异常变化 • 尾气CO2异常变化
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2. 污染原因分析 • 主要原因： ①种子带菌 ② 无菌空气带菌 ③ 设备渗漏 ④ 灭菌不彻底 ⑤操作失误 ⑥技术管理不善
2. 污染原因分析 • 从污染时间看：早期污染可能与①②④⑤→接种操作不当有关；后期污染可能与③⑤及中间补料有关。 • 从杂菌种类看： • 耐热芽孢杆菌：与④有关 • 球菌、无芽孢杆菌：与① ② ③⑤有关 • 浅绿色菌落的杂菌：与水有关，即冷却盘管渗漏 • 霉菌：与④⑤有关，即无菌室灭菌不彻底或操作问题 • 酵母菌：糖液灭菌不彻底或放置时间较长 • 从染菌幅度看：各个发酵罐或多数发酵罐染菌，且所污染的是同一种杂菌，一般是空气系统问题，若个别罐连续染菌，一般是设备问题。
3. 预防 • 种子带菌的防治 • 灭菌彻底 • 接种可靠：无菌室及设备可靠，无菌操作可靠 • 保藏可靠 • 过滤空气带菌的防治 • 设备的渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
“死角” • 发酵罐的“死角” 法兰、内衬、接口、表头、罐内部件及其支撑件如搅拌轴拉杆、联轴器、冷却盘管、挡板、空气分布管及其支撑件 口：人孔（或手孔）、排风管接口、灯孔、视镜口、进料管口 发酵罐罐底脓疱状积垢造成“死角” 消除方法：加强清洗并定期铲除污垢；安装放汽边阀 • 管道安装不当或配置不合理形成的“死角”
3. 预防 • 培养基与设备灭菌不彻底的防治 • 原料性状：大颗粒的原料过筛除去。 • 实罐灭菌时要充分排除罐内冷空气。 • 灭菌过程中产生的泡沫造成染菌：添加消泡剂 防止泡沫升顶 • 连消不彻底 ：最好采用自动控制装置 • 灭菌后期罐压骤变 • 死角 • 操作不当造成染菌 • 噬菌体染菌及其防治
采取哪些措施能够保持无菌发酵？ • 物料、培养基、中间补料要灭菌； • 发酵设备及辅助设备（空气过滤装置、各种发酵罐进出口连接装置）和管道要灭菌； • 好气发酵通入的空气要除菌； • 种子无污染；接种无菌操作过关； • 为了保持发酵的长期无菌状态，需维持正压。
三、发酵工业的无菌技术——灭菌方法 • 干热灭菌法 • 湿热灭菌法 • 射线灭菌法 • 化学药剂灭菌法 • 过滤除菌法 • 火焰灭菌法
四、培养基及设备灭菌 （一）湿热灭菌原理 （二）分批灭菌（实罐灭菌） （三）连续灭菌（连消） （四）分批灭菌与连续灭菌的比较
（一）湿热灭菌原理 1. 热阻 2. 微生物热死定律：对数残留定律 3.灭菌温度和时间的选择 4. 影响培养基灭菌的其它因素
1. 热阻 • 定义：微生物对热的抵抗力称为热阻，可用比死亡速率常数k来表示 。 k↓，热阻↑, t↑
1. 热阻 • 当温度T一定时，k随微生物不同而不同，具体计算时，可取细菌芽孢的k值为标准。 • 当 T 变化时，k有很大变化，其变化遵从阿累尼乌斯定律 k=Aexp(- △E/RT) ∴ k与微生物活化能及T有关
大肠杆菌在不同温度下 的残留曲线 嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢在不同温度下的死亡曲线
2. 微生物热死定律：(1) 对数残留定律 • 在一定温度下，微生物受热致死遵循分子反应速度理论，微生物受热死亡的速率-dN/dt与任何瞬间残留的活菌数N成正比，即 当Nt=0时， t=∞，既无意义，也不可能。 一般采用Nt=0.001，即1000次灭菌中只有一次失败。
(2) 非对数残留定律 • 某些微生物受热死亡的速率不符合对数残留定律：如一些微生物芽孢。 kR ks NR Ns ND dNR/dt=-kR NR dNs/dt =kR NR -ks Ns →Nt/N0=KR/(kR-kS) [ekst-ks/kR e-kRt] 式中NR：耐热性活芽孢数；Ns：敏感性活芽孢数 ND：死亡的芽孢数；kR：耐热性芽孢的比死亡速率； ks：敏感性芽孢的比死亡速率； N0：初始活芽孢数。
培养基中含有大量的不耐热的微生物和相当数量的耐热性微生物时的灭菌残留曲线 ∴在T相同时，对数与非对数定律的灭菌时间t不同。
3.灭菌温度和时间的选择 • 培养物质受热破坏也可看作一级反应： 式中C：对热不稳定物质的浓度；k’：分解速度常数； k’的变化也遵循阿累尼乌斯方程： 都与相应的活化能及T有关
3.灭菌温度和时间的选择 当T1 →T2 ㏑(k2/k1)/㏑(k2’/k1’)=ΔE/ΔE’>1 (∵ΔE>ΔE’) ∴随着T上升，菌死亡速率增加倍数大于培养基成分分解速率增加倍数，故一般选择高温快速灭菌 。
4. 影响培养基灭菌的其它因素 • 培养基成分 • 油脂、糖类及一定浓度的蛋白质、高浓度有机物等增加微生物的耐热性 • 低浓度（1%-2%）NaCl对微生物有保护作用，随着浓度增加，保护作用减弱，当浓度达8%-10%以上，则减弱微生物的耐热性。
4. 影响培养基灭菌的其它因素 • pH：pH6.0-8.0，微生物最耐热，pH<6.0，H+易渗入微生物细胞内，改变细胞的生理反应促使其死亡。∴培养基pH愈低，灭菌所需时间愈短。 • 培养基的物理状态 • 泡沫：泡沫中的空气形成隔热层，对灭菌极为不利，可加入少量消泡剂 。 • 培养基中的微生物数量
（二）分批灭菌（实罐灭菌）1.灭菌工艺过程 分空气过滤器灭菌 并用空气吹干 夹套或蛇管排冷水，开启排气管阀，空气管通蒸汽，也可夹套内通蒸汽 达70℃左右 保温阶段，凡液面以下各管道都应通蒸汽，液面上其余各管道则应排蒸汽，不留死角，维持压力、温度恒定 取样管 120℃，1×105pa 通蒸汽 保温 放料管 保温结束，依次关闭各排汽、进汽阀门 罐压接近空气压力 向罐内通无菌空气 夹套或蛇管中通冷水 培养基降温到所需温度
2.灭菌时间的估算 • 升温、冷却两阶段也有一定的灭菌效果，考虑到灭菌的可靠性主要在保温阶段进行，故可以简单地利用式 ㏑(N/N0) =-kt 来粗略估算灭菌所需时间。
2. 灭菌时间的估算 • 例1：有一发酵罐内装40m3培养基，在1210C温度下实罐灭菌，原污染程度为每1ml有2×105个耐热细菌芽孢，已知1210C时灭菌速度常数k=1.8min-1，求灭菌失败机率为0.001时所需时间。 解：N0=40×106×2×105=8×1012(个) Nt=0.001(个) k=1.8(min-1) ㏑(Nt/N0)=-kt t=2.303/k[lg(N0/Nt)]=2.303/1.8[lg(8×1015)] =20.34(min) 由于升温阶段就有部分菌被杀灭，特别是当培 养基加热至1000C以上，这个作用较为显著， 故实际保温阶段时间比计算值要短。
（三）连续灭菌（连消） • 工艺流程 • 喷淋冷却连续灭菌流程 • 喷射加热连续灭菌流程 • 薄板式换热器连续灭菌流程 • 灭菌时间的计算 ㏑(Ct/C0)=－kt t=2.303/k[lg(C0/Ct)] 式中：C0、Ct分别为单位体积培养基灭菌前、后 的含菌数。
连续灭菌时间的估算 • 例2．某发酵罐内装40m3培养基，采用连续灭菌，灭菌温度为1310C，原污染程度为每1ml含有2×105个杂菌，已知1310C时灭菌速度常数为15min-1，求灭菌所需的维持时间。 解：C0=2×105(个/ml) Ct=0.001/(40×106)=2.5×10-11(个/ml) t=2.303/k[lg(C0/Ct)]=2.303/15×lg[(2×105)/(2.5×10-11)] =2.37 min
分批灭菌与连续灭菌的比较 • 连续灭菌的优点：（适用于大型罐） • 可采用高温短时灭菌，营养成分破坏少，有利于提高发酵产率； • 发酵罐利用率高； • 蒸汽负荷均衡； • 采用板式换热器时，可节约大量能量； • 适宜采用自动控制，劳动强度小； • 可实现将耐热性物料和不耐热性物料在不同温度下分开灭菌，减少营养成分的破坏。
分批灭菌与连续灭菌的比较 • 缺点： • 对小型罐无优势，不方便，对设备要求高； • 蒸汽波动时灭菌不彻底； • 当培养基中含有固体颗粒或有较多泡沫时，以分批灭菌好，防止灭菌不彻底。
五、空气除菌 （一）概述 （二）空气过滤除菌流程 （三）空气预处理 （四）空气预处理流程设计应用举例 （五）空气过滤介质 （六）空气过滤除菌原理 （七）提高过滤除菌效率的措施
（一）概述 • 空气除菌的必要性 以一个50m3的发酵罐为例，若装料系数为0.7，要求每立方米发酵液每分钟通气0.8m3，培养周期170h，那么每个周期需通气量2.86×105 m3(50×0.7 × 0.8 × 170 × 60)，而每立方米大气中约有103-104个微生物。
（一）概述 • 空气除菌方法 • 辐射杀菌：超声波、高能阴极射线，x射线、β射线、γ射线、紫外线(2265Å ~3287 Å) • 加热杀菌：加热方法可用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量 • 静电除菌 ：常用于洁净工作台、洁净工作室所需无菌无尘空气的第一次除尘，配合高效过滤器使用。 • 过滤除菌：采用定期灭菌的介质来阻截流过的空气所含的微生物而取得无菌空气。常用的过滤介质有棉花、活性炭、玻璃纤维、有机合成纤维、有机和无机烧结材料等等。
1.对空气过滤除菌流程的要求 • 流程主要设备：空气压缩机 、空气过滤器 附属设备：粗过滤器、气液分离器、空气贮罐、空气冷却器
