生物技术

生物技术 Biological Techniques 主讲教师：梁学芬

前言

生物技术（Biological Techniques)二十一世纪是信息时代,是知识经济时代。知识经济时代有以六大技术为标志的高新科学技术群：电子信息、生物技术、新材料、新能源、海洋技术、航空航天技术。

生物技术是当今六大高新技术之一。我国把它列为六大高新技术之首。生物技术是世界各国普遍关注和重视的热点，如1973—1977年全世界约有400多家生物工程公司，到1992年单美国就创办2000多家生物技术公司，每年投入近60亿美元进行研究开发利用。生物技术是当今六大高新技术之一。我国把它列为六大高新技术之首。生物技术是世界各国普遍关注和重视的热点，如1973—1977年全世界约有400多家生物工程公司，到1992年单美国就创办2000多家生物技术公司，每年投入近60亿美元进行研究开发利用。

2000年世界生物技术产值估算超过6000亿美元。生物技术对解决当今社会许多重大问题，如人口、食物、能源、环境污染、人类健康等问题的解决发挥了极重要的作用。2000年世界生物技术产值估算超过6000亿美元。生物技术对解决当今社会许多重大问题，如人口、食物、能源、环境污染、人类健康等问题的解决发挥了极重要的作用。

绪论（preface)一、生物技术的定义及其用途 生物技术是一门重要的应用科学。（一）生物技术的概念（Biological Techniques)定义：以生命科学为基础，利用生物体系和工程原理，生产生物制品和创造具有特定性状的新品系或新物种的科学技术。

与生物技术有关的学科：生物学、分子生物学、细胞生物学、生物化学、微生物学、遗传育种学、数理化…… 形成和发展有赖于：化学工程学、电子学、计算机、材料科学、发酵工程科学……

（二）生物技术的内容：1、包括： 基因工程细胞工程酶工程发酵工程蛋白质工程：运用基因工程全套技术改变蛋白质结构的技术。染色体工程：探索基因在染色体上的定位，异源基因导入、染色体结构改变。生化工程：生物反应器及产品的分离、提纯技术。

生物反应器： 利用酶或生物体（微生物、动植物细胞）具有的功能，在生物体外进行化学反应的装置系统。

2、基因工程在基因水平上操作并改变生物遗传的技术，它的核心是重组DNA技术。基因工程包括：体外DNA重组体内基因操作基因化学合成等基因工程主要用酶作工具，切割 DNA，将DNA片段连接到载体（质粒、病毒等），形成遗传物质的新组合，然后再转移到寄主细胞中扩增和表达。

基因工程特点： 较复杂，难度较大，但它是分子生物学的生长点，有发展前途，能提高其他工程的层次。

3、细胞工程应用细胞培养、细胞融合等细胞生物学方法，以改善品种，生产生物制品及其组分的技术。包括：植物组织培养 生产植物次生代谢产物的细胞培养植物种质的保存和保持作物试管微型繁殖（快速繁殖、育种、无病毒）体细胞无性系突变体

初级代谢产物：维持细胞生长必需的代谢产物，它包括合成代谢的中间产物及终产物。 次生代谢产物：由初级代谢产物衍生而来，对生物的生存、生长、繁殖无关的那类代谢产物。4、酶工程：在一定生物反应装置中利用酶的催化作用，将相应的原料转化成有用物质的技术。

内容：酶的分离和提纯酶的开发与利用酶制剂的生产固定化酶和固定化细胞技术酶反应器的研究与设计酶电极的研究与应用酶分子的修饰改造酶抑制剂和激活剂的研究应用酶的人工模拟具有催化功能的大分子合成内容：酶的分离和提纯酶的开发与利用酶制剂的生产固定化酶和固定化细胞技术酶反应器的研究与设计酶电极的研究与应用酶分子的修饰改造酶抑制剂和激活剂的研究应用酶的人工模拟具有催化功能的大分子合成

5、发酵工程培养活细胞以取得生物体或代谢产物的技术。 四大工程互相联系，其中基因工程是生物技术的生长点、细胞工程是生物技术基础、酶工程是生物技术核心、发酵工程是生物技术工业化必由之路。二、生物技术的发展历史（1）生物技术的发端人类农业活动的开始——发端制酱、制醋、酿酒——最初的发酵技术

（2）生物技术的演变过程及其特征： 1857年发现了发酵现象； 20世纪初（1939年），用发酵法生产丙酮、丁醇制炸药；1942年发现青霉素；1953年提出DNA的双螺旋结构模型；1970年发现限制性DNA内切酶、连接酶；1973年基因重组成功； 1975年形成单克隆抗体。

生物技术特点： 以高科技为背景的高新技术；材料可更新、可循环、简单便宜，甚至可废物利用；常温下快速反应，耗能少；物料转化率高；工艺过程留下的废物可降解且无毒；产品涉及人类各方面（生活和生存的各方面）。

三、生物技术的应用七十年代以来，各种生物技术产品相继出台。并产生巨大经济效益。（一）农业1、提高作物产量、改良品质（1）选育作物优良品种：82年转抗卡那霉基因到烟草成功，提抗药性8倍,现已有4500多种作物转基因获得成功。包括粮作、烟草、经作、菜、牧草、瓜果、花卉、树木的抗基、高蛋白含量基因、固氮基因等。三、生物技术的应用七十年代以来，各种生物技术产品相继出台。并产生巨大经济效益。（一）农业1、提高作物产量、改良品质（1）选育作物优良品种：82年转抗卡那霉基因到烟草成功，提抗药性8倍,现已有4500多种作物转基因获得成功。包括粮作、烟草、经作、菜、牧草、瓜果、花卉、树木的抗基、高蛋白含量基因、固氮基因等。

（2）快繁：甘蔗一块生长锥培养143天， 产生1737株苗。（3）脱毒：茎尖无毒部分培养产生无毒苗。（4）人工种子：各国30多种作物可产生人工种子。（5）固氮（6）制无毒高效农药、除草剂（7）产生新物种

2、发展畜牧业（1）胚胎工程：胚胎移殖胚胎切割胚胎嵌合体性别控制核移植体外受精（2）转基因动物（3）饲料（4）疫苗2、发展畜牧业（1）胚胎工程：胚胎移殖胚胎切割胚胎嵌合体性别控制核移植体外受精（2）转基因动物（3）饲料（4）疫苗

（二）食品1、利用微生物生产单细胞蛋白质2、微藻的培养3、DNA重组技术使大肠杆菌生 产无壳鸡蛋4、定做新蛋白质5、发酵法生产6、人工合成

（三）医药应用广泛，特别是贵重药物生产、疫苗生产、新的诊病技术、新的治疗方法有特殊意义。 1、基因工程生产药物（1）生长激素（2）生长激素释放抑制素（3）胰岛素（4）干扰素

2、细胞工程生产药物3、发酵法、酶法生产抗生物质4、疾病诊治检测（1）单克隆抗体的应用：抗体：由抗原刺激在生物体内产生、并与抗原进行特异性结合的一类蛋白质的总称。抗原：能诱导动物产生抗体的任何化学物质。

抗原抗体反应有高度专一性、一种抗体只能与它相应的抗原相结合。抗原刺激 抗体单克隆抗体用途：A、诊病B、治疗疾病C、提纯D、检测E、单抗体内定位识别

5、基因疗法通过基因移植（或修复）的方法，消除（或修补）人体内的“坏”或“致病”基因，植入“好的”基因或“抗病”基因，使疾病得到治疗。6、 PCR技术7、生物信息学技术5、基因疗法通过基因移植（或修复）的方法，消除（或修补）人体内的“坏”或“致病”基因，植入“好的”基因或“抗病”基因，使疾病得到治疗。6、 PCR技术7、生物信息学技术

（四）能源、环境污染1、解决能源危机（1）改变石油开采途径（2）生物量的利用生物量：生物体及伴随其活动生成的有机 物的总称。A、燃烧B、微生物作用在常温下湿物质产生：乙醇、沼气

C、碳氢化合物某些植物（特别是大戟属植物）汁液中含有碳氢化合物可作石油代用品或作提取石油化学工业的各种原材料代用品。D、光合放氢特殊情况下：绿藻放氢蓝藻放氢细菌放氢

E、生物电池生物燃料电池：利用酶或微生物将没有电活性燃料转化为电活性燃料。如甲醇、甲醛、氢，加上电极后，燃料物质在氧化还原过程中自由能变电流。E、生物电池生物燃料电池：利用酶或微生物将没有电活性燃料转化为电活性燃料。如甲醇、甲醛、氢，加上电极后，燃料物质在氧化还原过程中自由能变电流。

2、消除环境污染生命活动是合成与分解周而复始，生命把原子及简单分子合成复杂分子。生物死后，细菌、酵母菌、霉菌等微生物又把其分解成简单的分子和原子。环境污染：生物圈（人、动物）产生的废弃物；人类开发产生的污染：农药、石油企业、工厂废水、气、渣。

防污染途径： 生化过程代替化学合成过程；生物农药代替化学农药，以虫治虫，菌治菌；阻止有害三废物质过度产生，尽量再循环利用。治理污染：物理法：燃烧化学法：燃发电生物法：微生物、酶降解有毒有害物质。

（五）采矿、工业 1、采矿 2、工业 3、国防

第一章基因工程及其应用 一、基因工程的概念及其内容在基因水平上操作并改变生物遗传的技术，它的核心是重组DNA技术，也称基因克隆、分子克隆。或：在分子水平上，用人工的方法提取（或者合成）不同的生物的遗传物质，在体外切割拼接和重新组合，然后通过不同方法把重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞进行复制与表达，按人的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定的遗传给下一代。

主要过程：抽取目的基因——切割——拼接——繁殖——表达。主要过程：抽取目的基因——切割——拼接——繁殖——表达。体外DNA重组： SDS、CTAB、尿素等方法提取DNA 酶作工具切割DNA DNA片段连接到载体上形成遗传物质新组合转移到寄主细胞中扩增表达体内基因操作基因化学合成

(一)体内基因重组：细胞内（体内）发生的DNA 重组现象 1、原理：供体（供给目的基因的生物体）DNA 受体（接受目的基因的生物）的DNA 生同源交叉（重组）使供体目的基因导入到受体的DNA 上，通过筛选获得重组体。通过两个转化实验就可以构造一个重组体，过程简便但局限性大，只能在特定的目标之下（DNA具一定同源性）才可运用。在体内发

质粒转化 DNA复制大肠杆菌同源配对提取质粒联会交换白色菌落转入半乳糖不发酵细菌半乳糖培养基特殊染色红色菌落

当前人们所说的基因工程一般是指体外基因工程或DNA体外重组，体外分子克隆技术。克隆：分子无性繁殖系通过无性繁殖从同一个祖先衍生的一群基因型相同的细胞或生物体，这些细胞和生物体基因型相同。

一、体外基因工程技术要点： 目的基因、工具酶、载体获得；目的基因与载体结合成重组DNA分子；重组DNA 分子引入受体细胞建立无性繁殖系；筛选所需的无性繁殖系，外源基因在受体细胞表达。

1、目的基因、工具酶、载体的获得 （1）目的基因：在基因工程中所需的基因来源：分离自然的基因人工合成基因化学合成酶促合成

（2）人工合成 DNA合成仪合成基因：化学方法合成较小核苷酸片段缓慢冷却过程中互补的区段形成双链连接酶的作用下，把多核苷酸片段连接起来加上调控顺序（起始子、终止子）（3）分离自然基因：方法很多：利用理化方法分离、鸟枪法、菌落显色法、分子杂交法、阻遏物结合法……

2、载体： 是较小的DNA分子，用来运载和保护外源DNA，使目的基因顺利进入受体细胞并在其内复制和表达。（1）载体的功能（条件）能在宿主细胞中自我复制，并能稳定的保存，有一定的内切酶切点（每种酶对其最好只有一个切点）能嵌入外源DNA片段，而且外源DNA嵌入后依然保持其复制能力。具可作为重组DNA分子选择的遗传标记。例如：细菌（大肠杆菌、酵母菌、枯草杆菌……）的质粒入噬菌动物病毒如类人猿病毒 SV 40 农杆菌质粒（Ti 、Ri ）

（2）质粒（细菌） 细菌中独立于染色体并能自我复制的DNA 双键闭环DNA分子，细胞分裂时，能稳定地传递给子代的遗传因子经改造后质粒有不同的表型

（3）农杆菌 农杆菌有根瘤农杆菌（含Ti质粒）和发根农杆菌（含Ri质粒），他们之中有一段可转移的T-DNA。由于根瘤农杆菌的Ti质粒上的T-DNA能被植物细胞整合，并稳定表达和传递给下一代，因而Ti质粒用作植物基因工程载体。具体操作过程：外源目的基因 Ti质粒重组质粒转入植物细胞。插入感染植物

3．工具酶：主要是内切酶和连接酶 （1）限制性内切酶内切酶有三种类型：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，以Ⅱ型多用。 Ⅱ型：分子量较小；与底物作用时，只要有Mg+2 存在就能发生作用；切割点高度专一；造成粘性末端，如ECORI CTTAAG GAATTC

由于同一种内切酶造成的单链尾巴碱基顺序相同，所以极性相反的单链尾巴一定是互补的，不同来源的DNA经同一种内切酶切割后混在一起，就会通过粘性末端的碱基互补配对而自动靠拢。也有一些内切酶的切口是平的： CCCCGGGG GGGGCCCC

（2）连接酶 内切酶造成的粘性末端只能使DNA片段的互补单链尾巴彼此靠拢，但不能连接，连接酶把一个DNA片段5‘端的磷酸基因同另一个DNA片段的3‘端糖环上的羟基（-OH）以酯键的方式连接成一连续的DNA分子。 2．重组DNA分子用同一种限制酶，切割不同来源的DNA产生DNA片段，可通过粘性末端对应碱基间的氢键集合到一起，并经DNA连接酶的作用，将切口接合起来，成一定完整的重组DNA分子。

3．转化和筛选 1）转化目的基因同载体连接以后，便要将重组的载体输入受体细胞。受体细胞主要是细菌，如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、放线菌和动植物细胞等。

转化过程： 受体菌0、1MCaCl2 （冷）处理，使细胞成感受态（大肠杆菌细胞）加入外来DNA分子，使与之相混合混合吸附（外来DNA完整的双链DNA分子吸附在受体菌的表面）转入（双链DNA分子解链，单链DNA进入受体菌、另一链降解）自稳（外源质粒DNA分子在细胞内又复制成双链环状DNA）表达（供体基因随同复制子同时复制，并被转录转译）转化成功率占DNA分子0.01%左右

感受态：细菌吸收转化因子（周围环境中的DNA分子）的生理状态。感受态：细菌吸收转化因子（周围环境中的DNA分子）的生理状态。（2）筛选接受了外源DNA的宿主细胞，只有其中一小部分含有需要的基因，因此，重组DNA分子进入受体细胞后，就要从细胞群中选出含有所需重组分子的细胞，然后再繁殖成含所需基因的无性繁殖系（基因克隆）。

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