1 / 71

אינטראקציות בין חלבונים

אינטראקציות בין חלבונים. אריאל טלבי איילת הרשטיק. מבוסס על המאמרים הבאים:. Legrain P et al, Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet. 2001;17(6):346-52.

taryn
Download Presentation

אינטראקציות בין חלבונים

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. אינטראקציות בין חלבונים אריאל טלבי איילת הרשטיק

  2. מבוסס על המאמרים הבאים: • Legrain P et al, Protein--protein interaction maps: a lead towards cellular functions, Trends Genet. 2001;17(6):346-52. • von Mering C et al. (2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403. • Tong AH et al. (2002) A combined experimental and computational strategy to define protein interaction networks for peptide recognition modules. Science. 295(5553):321-324. • Jansen R et al (2003) A Bayesian networks approach for predicting protein-protein interactions from genomic data. Science. 302(5644):449-453 • מוסנזון, א. מבוא לרשתות בייסיאניות. www.cs.huji.ac.il/~mosenzon/bayes_lec.doc

  3. במה נעסוק היום? • נכיר שיטות לבדיקת קיומם של קשרים בין חלבונים (in vivo, in vitro & in silico) • נשווה בין יעילותן של השיטות ונלמד על מידת דיוקן • נראה טכניקות עדכניות לטיפול במידע שקיבלנו והסקת מסקנות ממנו

  4. מהן חשיבויות חקר הקשרים בין חלבונים? • הבנת תפקודם של חלבונים לא מוכרים חלבון בעל תפקיד בלתי ידוע A חלבון בעל תפקיד ידוע B קשר בין חלבונים הבנה טובה יותר של חלבון A

  5. מהן חשיבויות חקר הקשרים בין חלבונים? • הכרת מסלולים מולקולרים חדשים וקשר בין מסלולים מוכרים באורגניזם חלבון בעל תפקיד ידוע מסלול B קשר בין חלבונים חלבון בעל תפקיד ידוע מסלול A כנראה קיים קשר ביולוגי בין מסלולים A ו- Bלעיתים כך ניתן להבין תהליך שלם באורגניזם

  6. מה קרה דווקא בשנים האחרונות? • פותחו שיטות לזיהוי מאסיבי של קשרים ברמות שלא הכרנו קודם לכן • שיטות אלו גרמו לכריית מידע בכמויות גדולות, מידע הדורש טיפול וניתוח הולם • נעבור על השיטות המרכזיות לזיהוי אינטראקציות בין חלבונים

  7. AD bait DBD fish שיטה 1 (H2Y)Yeast two hybrid assay אחד החלבונים (bait) מחובר לאזור הקושר DNA (DBD) בפקטור שעתוק (בד"כ Gal4) שני חלבונים מבוטאים כ–fusion proteins (hybrids) בשמרים השני (fish) מחובר לאזור המאקטב שעתוק של אותו פקטור (AD), שמנותק מהאזור הקושר DNA

  8. AD bait DBD fish Reporter gene שיטה 1 (H2Y)Yeast two hybrid assay Transcription Complex transcription UAS

  9. שיטה 1 (H2Y)Yeast two hybrid assay הפלסמידים הנושאים את רצפי ה- DNA המקודדים ל bait מוחדרים לשמרים מזוויג אחד פלסמידי ה fish מוחדרים לזוויג השני זיווג ויצירת דיפלואיד יתנו לנו את מערך הניסוי המתאים לבדיקת הקשר בין ה fish וה bait כל אינטראקציה בין החלבונים תביא ליצירת פקטור שעתוק פעיל, ובכך לביטוי של ה- mRNA

  10. Plasmid A Plasmid B DBD AD bait fish promoter promoter Yeast B Yeast A שיטה 1 (H2Y)Yeast two hybrid assay פרו ורבו

  11. Yeast שיטה 1 (H2Y)Yeast two hybrid assay Report of the gene only in case of interaction Between the two proteins

  12. יתרונות וחסרונות בשיטה 1: יתרונות : * גילוי קשרים in vivo * גילוי קשרים זמניים ובלתי יציבים חסרונות: * ביטוי כ- fusion protein יכול להפריע לקשרים תלויי קונפורמציה * חלבונים נבדקים בזוגות ולא נמצא קשרים תלויי קואופרטיביות * האינטראקציות בגרעין, וישנם לכן חלבונים שלא בסביבתם הטבעית * מגלה קשרים אפשריים גם את בפועל הם אינם מתרחשים (ללא קשר למצב הפיזיולוגי)

  13. Protein–protein interaction maps: a lead towards cellular functions Pierre Legrain, Jérôme Wojcik and Jean-Michel Gauthier TRENDS in Genetics Vol.17 No.6 June 2001

  14. בניית מפת אינטרקציות • שימוש ב- Yeast 2 Hybrid system • מיפוי אינטרקציות בגישת המטריצה • מיפוי בעזרת סריקת ספריות מקטעים • יתרונות וחסרונות הגישות

  15. גישת המטריצה • סט חלבונים קבועים מראש • בדיקת כל הצמדים • B4 מאקטב לבד (ללא צורך באינטרקציה) – מסונן • P1 מגיב עם חלבוני Bait רבים לא קשורים (Sticky) - מסונן Pierre Legrain, Jérôme Wojcik and Jean-Michel Gauthier TRENDS in Genetics Vol.17 No.6 June 2001

  16. מגבלות הגישה • בודקת רק חלבונים קבועים מראש. • כמות false-negatives גדולה מאד. • Reproducibility נמוכה. • צורך להגדיר תנאי בדיקה אחידים לכל הריאקציות. • מתבצעות רק 2 אינטרקציות לכל זוג חלבונים, לכן הסיכון שמוטציה תשבש את התוצאות גדל. • סינון אוטו-אקטיבטורים וsticky עלול לפספס אזורים באותו חלבון המשתתפים באינטרקציות ספציפיות.

  17. סריקת ספריות פרגמנטים • חותכים את הDNA למקטעים אקראיים רבים וחופפים. • משבטים לתוך וקטורי fish ומקבלים ספריית דגים. • בוחנים מול קבוצת Bait קבועה מראש. • תוצאה חיובית- קטע חופף בין מספר מקטעים שעוברים אינטרקציה. Pierre Legrain, Jérôme Wojcik and Jean-Michel Gauthier TRENDS in Genetics Vol.17 No.6 June 2001

  18. סריקת ספריות פרגמנטים • שימוש בסט פתיונות השייכים לאותו מסלול מאפשר מציאה ואיפיון של חלבונים נוספים באותו מסלול. • שימוש בדגים שהם מקטעים שנחתכו בצורה אקראית מאפשר זיהוי של האזורים בחלבון העוברים אינטרקציה.

  19. סריקת ספריות פרגמנטים • 1997 – מחקר פיילוט בשמרים ( Fromont-Racine, M. et al. ): • סריקת ספריה גנומית עם 12 חלבוני פיתיון המוכרים במסלול RNA Splicing. • זיהוי הדגים החיוביים ע"י ריצוף, וסיווג עפ"י ערך היוריסטי של "חשיבות ביולוגית". • שיבוט חלבוני הדג המבטיחים ביותר אל תוך חלבוני פיתיון, וסריקת הספריה בעזרתם – וחוזר חלילה בתהליך איטרטיבי. • תוצאות: זיהוי 170 אינטרקציות המחברות 145 חלבונים, וזיהוי פקטורי שחבור חדשים בשמר.

  20. גישות גנומיות נוספות למחקר פונקציונליות חלבונים • Global Gene Expression- ביוטי משותף של mRNA. • Genome-wide Mutagenesis– השריית מוטציות בשיטתיות, ובדיקת הפנוטיפ. • על אף שהמידע הפנוטיפי הוא אינפורמטיבי, הוא תיאורי בעיקרו ואינו מספק מידע על אינטרקציות ביוכימיות.

  21. מגבלות הגישה • דורש הכנה של חלבוני דגים רבים מאד ומורכבים מאד, וסינון של המון אינטרקציות- ולכן יקר. • עלולות להתקבל תוצאות שגויות (false positive) כתוצאה מאוטו-אקיבטורים, sticky fragments. • סריקת ספריה אקראית עלולה למצוא זוגות מקטעי חלבונים העוברים אינטראקציה ביניהם, שאין לה חשיבות ביולוגית.

  22. סיכום ביניים • לכל אחת מהשיטות שראינו יש מגבלות, וסבירות שונה ל- False Positives ול- False Negatives. • על כן, יש לשקלל כל מקור מידע בהתאם לאמינותו, עפ"י הטכנולוגיה שבה הושג.

  23. הקדמה Mass spectrometry • זיהוי חלבונים בהסתמך על הרצף והמסה שלהם • שיטה לדוגמא – Peptide Mass Fingerprinting • לאנזים פרוטאוליטי ישנו רצף הכרה מסוים בו הוא חותך • החלבון (או הקומפלקס) מעוכל ע"י אנזים פרוטאוליטי ומתקבלים פפטידים באורכים שונים • הסגמנטים מורצים בג'ל כדי להפרידם לפי מסה • כל חלבון נחתך בצורה ייחודית כתלות ברצף שלו - 'טביעת אצבע' • טביעות האצבע של כל החלבונים ידועות מחיתוך in silico שלהם, ונמצאות במאגרי נתונים

  24. הקדמה Mass spectrometry A mass spectrometer is an instrument that measures the masses of indiviual molecules that have been converted into ions, i.e., molecules that have been electrically charged http://www.asms.org/

  25. הקדמה Mass spectrometry Mass spectrum of Carbon dioxide A mass spectrum is a graph of ion intensity as a function of mass-to-charge ratio http://www.asms.org/

  26. שיטה 2 א'Co-immunoprecipitation לוקחים קולונה שלדפנותיה מקובע נוגדן המזהה אפיטופ של חלבון bait כלשהו מעבירים בקולונה ציטופלזמה של תאים חלבון ה bait נקשר לנוגדנים השונים ואליו קשורים חלבונים נוספים המקיימים איתו אינטראקציה. אח"כ הקומפלקסים מבודדים ע"י שטיפה ומרכיביהם מזוהים ע"י MS

  27. שיטה 2 א'Co-immunoprecipitation לוקחים קולונה שלדפנותיה מקובע נוגדן המזהה אפיטופ של חלבון bait כלשהו מעבירים בקולונה ציטופלזמה של תאים חלבון ה bait נקשר לנוגדנים השונים ואליו קשורים חלבונים נוספים המקיימים איתו אינטראקציה. אח"כ הקומפלקסים מבודדים ע"י שטיפה ומרכיביהם מזוהים ע"י MS www.dchip132.com

  28. תג fish bait שיטה 2 ב'Epitope tagging • זהו שכלול של השיטה הקודמת: • לחלבון ה bait מחובר תג שאותו מזהה הנוגדן התג מחובר עוד בשלב ה-cDNA לקבלת fusion protein שאותו יבטא התא בעזרת הפרומוטור האנדוגני הרעיון: אין צורך למצוא נוגדן ספציפי לכל חלבון שרוצים לבדוק - הרבה חלבונים יכולים להיבדק על ידי אותו נוגדן נוגדן

  29. שיטה 2 ב'Epitope tagging • יתרונות ה Epitope tagging: * מציאת קשרים פיזיים אמיתיים בתנאים פיזיולוגים * מציאת אינטראקציות בין קומפלקסים שלמים, ולא רק אינטראקציות בין זוגות של חלבונים * ניתן לערוך כמה ניסויים על אותו הקומפלקס כאשר בכל פעם חלבון אחר מתוייג, ובכך נבדקת עקביות

  30. שיטה 2 ב'Epitope tagging • חסרונות ה Epitope tagging: * קומפלקסים שלא נוצרים בתנאי המעבדה לא יתגלו * התגים עלולים להפריע לקיום האינטראקציות * קומפלקסים לא יציבים עלולים להישטף החוצה

  31. מבנה שיטה 2: MS א ב Co-immunoprecipitation Epitope tagging 2 1 HMS- PCI TAP

  32. שיטה 2 ב' (1)TAP – Tandem Affinity purification • Epitope taggingעם שני תגים שונים מחוברים • הקומפלקס עובר טיהור ראשון כרגיל • מוסיפים אנזים פרוטאוליטי החותך ברצף שבין שני התגים • הקומפלקס עובר טיהור שני • כך מצליחים להיפטר מהרבה קשרים לא ספציפיים

  33. נוגדן 2 תגים שיטה 2 ב' (1)TAP – Tandem Affinity purification קולונה 1 פרוטאוליט קרניבורי קישור לא ספציפי קולונה 2

  34. שיטה 2 ב' (2)HMS-PCIHigh-Throughput Mass-Spectrometric Protein Complex Identification • גם זו שיטה של Epitope tagging • חלבון הפיתיון מבוטא יותר מאשר במצב הטבעי שבתא החי - inducible overexpression • כך מוצאים קשרים גם עבור חלבונים שאינם מבוטאים בתא בתנאי המעבדה

  35. שיטה 2 ב'Epitope tagging • מה ההבדלים אם כן בין TAP ל HMS-PCI ? ב TAP הסיכוי נמוך יותר לקבל False positives, זאת בשל ה"סינון הכפול". לעומת זאת ב HMS-PCI יש פחות סיכוי לקבל False negatives, זאת בשל הביטוי המוגבר המסייע בזיהוי קשרים רבים יותר.

  36. שיטה 3Correlated mRNA expression(Synexpression) • כמויות ה-mRNA נבדקות תחת תנאי סביבה משתנים בעזרת DNA chips • גנים המראים תבנית ביטוי דומה (למשל בחום או הרעבה לאלאנין), מוכנסים לאותה קבוצה –clustering • גנים באותו cluster עוברים כנראה רגולציה משותפת (כי הם מופיעים יחד) ורבים מהם עוברים אינטראקציות ביניהם התמונה נלקחה מ: www.dchips132.com

  37. שיטה 3Correlated mRNA expression(Synexpression) יתרונות השיטה: * פועלת in vivo * מכסה הרבה מצבים פיזיולוגים (יותר מהשאר!) * מהירה וקלה (כי קל לנתח רצפי RNA) חסרונות השיטה: * מגלה קשרים עקיפים שלא מעידים בהכרח על אינטראקציה פיזית * רגישה לפרמטרים הנבחרים ולשיטות ה clustering

  38. שיטה 4Genetic Interactions(Synthetic lethality) • נקח 2 גנים לא חיוניים, כאשר מוטציה בכל אחד מהם היא לא קטלנית לאורגניזם. אם מוטציה בשניהם יחד היא קטלנית – נוכל להסיק כי הם בעלי פונקציונליות משותפת והחלבונים המקודדים ע"י גנים אלו עשויים להיות קשורים גם פיזית. * התהליך נעשה ע"י מוטציות מותנות

  39. שיטה 4Genetic Interactions(Synthetic lethality) יתרונות השיטה: * פועלת in vivo * מאפשרת סריקה של כל הגנום ללא תלות מיקום חסרונות השיטה: * מגלה קשרים עקיפים ולא בהכרח פיזיים * קשה לדעת את אופי המוטציה ומקומה, ולכן קשה להשליך מהן על תפקוד החלבונים

  40. שיטה 5In Silico Predictions Through Genome Analysis • גנומים שלמים עוברים סריקה במחשב עבור רמזים לאינטרקציות בין חלבונים: • השתייכות לאותו אופרון - בפרוקריוטים • הימצאות או העדרות באותם יצורים - פרופיל פילוגנטי דומה • הימצאות החלבונים, שנמצאים בנפרד באורגניזם אחד, באורגניזם אחר כשבו הם מהווים fusion protein באופן טבעי

  41. שיטה 5In Silico Predictions Through Genome Analysis יתרונות השיטה: * שיטה מהירה וזולה * כיסוי השיטה גדל ככל שיותר גנומים מרוצפים חסרונות השיטה: * השיטה מנבאת קשרים תיאורטית, ללא הוכחה לאינטראקציה פיזית * מחייבת בניית רשתות אורתולוגיות, ולכן נכשלת כאשר הקשרים האורתולוגיים אינם ברורים * תקפה כרגע בעיקר לפרוקריוטים

  42. סיכום השיטות שלמדנו: • שיטות המגלות אינטראקציות ישירות: - Y2H(in vivo) - MS(in vitro) שיטות עקיפות: - Synexpression(in vivo) -Synthetic lethality(in vivo) - In silico predictions(in silico)

  43. כיצד נטפל במידע שקיבלנו? ניתן לסנן את איכות המידע שקיבלנו ע"י השוואה בין תוצאות מכמה שיטות von Mering C et al. (2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403.

  44. דוגמא לסינון תוצאות נוסף: • ב-MS of purified complexes ניתן להתחשב רק בקשרים עם חלבון ה bait ולא בקשרים בין שאר חלבוני הקומפלקס • כך מגדילים את הדיוק מ-2% ל-6.8% ב-HMS-PCI ומ-12.5% ל-27.8% ב-TAP • כמובן, זה גורר גם ירידה גדולה בכיסוי של השיטות

  45. כ- 80,000 אינטראקציות נמצאו עד 2002 בשמר בשיטות ה- high throughput השונות • רק 2,400 מהן נסמכות על יותר משיטה אחת! • הסברים אפשריים לכך: • השיטות עוד לא הגיעו לרוויה (לא נבדקו כל האפשרויות) • השיטות מגלות false positives רבים • לרוב השיטות יש קושי בגילוי אינטראקציות מסוגים מסויימים – false negatives

  46. בדיקת יעילות השיטות מול קשרים ידועים (רפרנס של 10,907 קשרים מוכרים): Coverage (%) ישנו trade-off בין כיסוי לדיוק כשפילטר הסינון משתנה von Mering C et al. (2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403. Accuracy (%)

  47. הטיית תוצאות (biases) • ניתן לזהות 3 אספקטים בהם השיטות שלמדנו נותנות תוצאות "מוטות" לכיוון מסויים 1. יש נטייה למציאת קשרים בין חלבונים השכיחים יותר בתא 2. שיטות מסויימות נוטות למצוא קשרים במיקומים מסויימים בתא (למשל in silico נוטה למצוא קשרים דווקא במיטוכונדריה) 3. חלבונים "ותיקים" נוטים לככב יותר מאשר חלבונים הייחודיים לאורגניזם המסויים.

  48. הנטיות של השיטות השונות ניתן לראות שלכל שיטה יש נטייה לגלות יותר אינטראקציות במקומות שונים בתא von Mering C et al. (2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403. כיסוי החלבונים השונים עפ"י האינטראקציות הידועות פיזור החלבונים לפי הגנום

  49. אינטראקציות בתוך כל קטגוריה ספציפית הגרף מראה את אחוז החלבונים השייכים לאותה קטגוריה מתוך אוסף הקשרים שנתגלו בכל שיטה von Mering C et al. (2002) Comparative assessment of large-scale data sets of protein-protein interactions. Nature. 417(6887):399-403. שאלה: מדוע דווקא Synthetic lethals הם בעלי אחוז גילוי גבוה לאותה קטגוריה?

  50. הפסקה

More Related