Репликация ДНК: процесс Лекция 6

1. Репликация ДНК: процессЛекция 6 МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА

2. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Словарик

3. Словарик Клеточный цикл – период жизни клетки от одного деления до другого или от деления до смерти Репликативная вилка – Y-образная структура, перемещающаяся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующаяся местным расхождением двух её цепей, в пределах которой происходит активная репликация ДНК Ориджин (ori)– участок репликона, с которого начинается процесс репликации

4. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Общая характеристика процесса

5. Репликация – полимеразная реакция, обеспечивающая процесс матричного синтеза молекулы ДНК и приводящая к ее самовоспроизведению (удвоению).

6. Основные структурные элементы

7. Репликонные системы

8. Ориджины репликации Сборка белковых комплексов и формировнаниерепликативной вилки начинается в определенной участке ДНК – Origin (Ori) Схема ori вируса SV40 ORE (origin recognition element) –участок связывания белка Т-антигена (Т-аg) DUE (DNA unwindingelement) – участок для связывания белка, расплетающего ДНК ТА – элемент, обогащенный АТ-нуклеотидами OBR (originbidirectionalreplication) – начало двунаправленной репликации Аux-1 – вспомогательный элемент, связывает димеры Т-антигена Аuх-2 – связывает фактор транскрипции Sp1

9. Формы движения репликативной вилки

10. Одноправленнаярепликативная вилка

11. Двунаправленная репликативная вилка

12. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Основные стадии репликации

13. Основные стадии репликации

15. Хромосома E. coli (4,2 млн. п.н.) – один репликон

16. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Репликация ДНК у прокариот

17. ДНК-полимеразы прокариот (E.coli)

18. ДНК-полимеразы прокариот ДНК-полимеразаIIIявляется репликазой, синтезирует обе цепи ДНК, обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’ экзонуклеазной ДНК-полимеразы I действует на запаздывающей цепи для удаления РНК-праймеров (5’ →3’экзонуклеазы) и дорепликации очищенных мест ДНК, выполняет репаративную функцию, обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’ экзонуклеазной ДНК-полимераза II имеет отношение лишь к репарации, обладает активностью 5’ → 3’ полимеразной и 3’ → 5’ экзонуклеазной

19. ДНК полимеразы прокариот: ДНК полимераза III Осуществляет синтез ведущей цепи ДНК и фрагментов Оказаки при синтезе отстающей цепи. Holo-фермент состоит из 10 субъединиц, каждая из которых обладает своей функцией.

20. ДНК полимеразы прокариот: ДНК полимераза I ДНК-полимераза Корнберга, состоит из одной полипептидной цепи (109 кДА)

21. ДНК полимеразы прокариот: ДНК полимераза II ДНК-полимераза II (кольцеобразная структура, состоящая из нескольких одинаковых молекул белка, показанных разными цветами), лигирующая повреждённую цепь ДНК

22. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Стадия инициации у прокариот

23. Общая схема репликация E.coli

24. Формирование пререпликативного комплекса и репликативной вилки Репликация в оriС начинается с формирования комплекса, в состав которого входят шесть белков: DnaА, DnaВ, DnaС, НU, Girase и SSВ Структура (ori С) E.coli • Особенности структуры ДНК Ori-участков: • негативная суперспирализация ДНК • присутствием «легкоплавких» А-Т участков ДНК • Места для связывания со вспомогательными белками

25. Белок DnaA • Функции: • узнает область начала репликации oriC, последовательно связываясь с нонамерными повторами в ДНК – блоками DnaA • способствует расплетанию легкоплавких АТ-богатых участков ДНК oriC • вербует на расплетенные участки oriCDnaB (хеликазу) Структура белка DnaA E. coli. I-IV - области гомологии бактериальных белков DnaA 1 - домен олигомеризации 2 - области связывания с хеликазой DnaВ, 3 - сайт связывания нуклеотидов 4 - домен АТФазной активности 5 - участок взаимодействия с мембранными фосфолипидами 6 - домен связывания с ДНК

26. Связывание инициаторного белка Dna A c ДНК Сначала с 9pb последовательностью связывается мономер DnaА, затем 20–40 мономеров этого белка формируют большой агрегат. ДНК ориджина опоясывает его, и цепи ДНК разъединяются в области трех 13 pb последовательностей. На следующем этапе димерDnaВ/DпаС присоединяется к комплексу oriС/DnaА – формируется репликативная вилка.

27. а) присоединение DnaА (инициирующий белок) b) присоединение DnaB (хеликазы) c) Присоединение и DnaG(праймазы) – образование праймосомы, комплекса, содержащего хеликазу и праймазу

28. DnaВ расплетает двухцепочечную ДНК при использовании энергии АТФ. Скорость расплетения составляет около 6000 нукл. в сек.

29. SSB-белки удерживают одноцепочечные ДНК от ассоциации. По мере продвижения репликационной вилки SSB диссоциируют с одного места и присоединяются на другом. Этот процесс не требует затрат энергии АТФ.

30. Формируется праймосома. Фермент праймаза синтезирует праймеры. ДНК-полимераза III присоединяет к праймерупервый нуклеотид.

31. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Стадия элонгации у прокариот

32. ДНК-полимеразаIII присоединяет к праймеру следующий нуклеотид. Идет синтез ведущей и отстающей цепи. Обе цепи реплицируются синхронно, что достигается взаимодействием хеликазы, праймазы и ДНК-полимеразы и торможением синтеза лидирующей цепи во время синтеза праймеров.

33. Когда синтез на одном из фрагментов Оказаки достигает праймера другого фрагмента ДНК-полимераза I удаляет праймер, имеющейся у полимераз 5‘ → 3' экзонуклеазной и 5’ → 3’ полимеразной активностью (исключение праймера). После этого сахарофосфатный остов между фрагментами сшивается ковалентной связью при помощи ДНК-лигазы.

34. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Стадия терминации у прокариот

35. Организация репликонаE. coli aattagtatgttgtaactaaagt tus (tbp) 36 кДа Терминация репликации у прокариот происходит, когда «репликационная вилка»достигает участка ДНК с особыми сайтами ter и, если с ДНК этих сайтов соединится продукт гена tus.

36. Общая схема репликации у прокариот

38. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Репликация у эукариот

39. МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕНЕТИКА. РЕПЛИКАЦИЯ Инициация

40. Клеточный цикл G1-фаза – фаза начального роста, во время которой идет синтез mРНК, белков, других клеточных компонентов S-фазы – фаза, во время которой идет репликация ДНК клеточного ядра, происходит удвоение центриолей G2-фаза – фаза подготовки к митозу

42. G1-фаза. Образование перепликативный комплекс Пререпликативныйкомплексвключает: Инициирующие белки связываются с Ori Дестабилизирующие белки (RPA эукариот или SSB прокариот)

43. S период. Образование репликативной вилки В S периоде пререпликативныйкомплекс преобразуется в репликативныйкомплекс, который обеспечивает связь необходимых для репликации белков, раскручивание двойной спирали ДНК, собственно репликацию.

44. Инициация репликации

45. Пререпликационный комплекс состоит из : ORC – шестисубъединичный комплекс, который распознает и связывается с ori репликации Cdc6 и Cdt1 – регуляторные белки, которые используются ORC MCM – хеликазный комплекс (белки поддержания минихромосом) Эти белки собираются на ori репликации в G1 фазе клеточного цикла. После сборки белки MCM фосфорилируются и начинается репликация ДНК.

46. Комплексы инициации транскрипции у эукариот

47. Комплексы инициации транскрипции у эукариот

48. ДНК полимеразы эукариот

49. Схема репликации ДНК эукариот. Инициация 1.При участии топоизомеразы I и II, хеликазы и RPA - белков(Replication Protein A) образуется репликативная вилка, которая движется по цепи в обоих направлениях.

50. Схема репликации ДНК эукариот. Инициация 2.Комплекс α-ДНК-полимераза-праймаза – обеспечивает образование РНКового праймера