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标记免疫技术 1

标记免疫技术 1. 微生物与免疫教研室. 实验四、 双抗体夹心法测甲胎蛋白含量. 一、实验目的： 1. 掌握常见的免疫标记方法和标记物。 2. 掌握 ELISA 实验原理、类型和操作技能。 3. 掌握金标免疫层析实验原理和结果判断。 4. 熟悉 ELISA 操作基本步骤及实验注意事项。 5. 熟悉酶标仪的使用。. 标记免疫技术

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标记免疫技术 1

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Presentation Transcript

  1. 标记免疫技术 1 微生物与免疫教研室

  2. 实验四、 双抗体夹心法测甲胎蛋白含量

  3. 一、实验目的： 1. 掌握常见的免疫标记方法和标记物。 2. 掌握ELISA实验原理、类型和操作技能。 3. 掌握金标免疫层析实验原理和结果判断。 4. 熟悉ELISA操作基本步骤及实验注意事项。 5. 熟悉酶标仪的使用。

  4. 标记免疫技术 标记免疫是具有高度特异性的免疫技术和 高度敏感性的标记技术相结合的特点，标记免疫技术一经问世，就显示了在血清学方面的巨大潜力，大多数经典的血清学分析都以抗原抗体反应的二级现象为基础。诸如凝集、沉淀、补体固定等。而标记免疫分析是测量抗原抗体间初级反应的分析方法，其灵敏性是过去血清学方法无法比拟的。

  5. 按标记不同，标记免疫分析分为： • 放射免疫分析（radioimmunoassay, RIA）： 放射性核素作标记 • 酶免疫分析（enzyme immunoassay, EIA）： 酶作标记 • 荧光免疫分析（fluorescence immunoassay, FIA）：荧光物作标记 • 发光免疫分析（luminescence immunoassay, LIA）：发光物作标记

  6. 酶免疫技术 1.原理：以酶标记的抗体（或抗原）作为主要试剂，将抗原抗体反应的特异性和酶高效催化反应的专一性相结合的一种免疫检测技术。酶结合物既保留抗体（或抗原）的免疫学活性，又保留酶对底物的催化活性。 2.特点：灵敏度高、特异性强、准确性好、试剂稳定、方法简便易行

  7. 酶免疫技术分类：

  8. 均相酶免疫测定 • 原理：利用Ab-E结合Ag形成AgAb-E复合物后，标记酶 ( E ) 的活性会发生改变的基本原理，可以在不将AgAb-E与Ab-E分离的情况下，通过直接测定系统中总的标记酶活性改变，即可确定AgAb-E的形成量，并进而推算出样品中待检Ag浓度。 • 应用：小分子抗原或半抗原的检测

  9. 异相酶免疫测定 • 液相： • 原理同放射免疫测定 • 固相： • ELISA

  10. 基本原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面 ②受检标本和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开 ③结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。 ④由于酶的催化频率很高，故可极大地地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

  11. 酶和酶作用底物 • （一）对酶的要求 • 活性高 • 易与抗体、抗原结合，对标记的蛋白活性无影响 • 结果易判断 • 不受标本的影响 • 安全、性质稳定，价廉

  12. ELISA中最常用的酶 • HRP ：分子量较小，标记物易透入细胞内，酶及酶标记物比较稳定，易保存溶解性好 • AP：分子量较大，不易透入细胞内，敏感性高 • b-Gal：人血中缺乏此酶，在测定时不易受到内源性酶的干扰，常用于均相酶免疫测定。

  13. 辣根过氧化酶（HRP）对应的底物OPD和TMB的比较

  14. 碱性磷酸酶和β半乳糖苷酶的比较

  15. 方法类型 1. 双抗体夹心法：检测Ag最常用的ELISA 适用条件为Ag分子中具有至少两个抗原决定簇

  16. 2. 间接法：检测Ab的最常用的方法 只要更换不同的固相Ag，可以用一种酶标二抗检测各种与Ag相应的Ab。

  17. 3.竞争法测抗体

  18. 4. 竞争法测抗原

  19. 5 捕获法 • 用于血清中某种抗体亚型成分的测定

  20. 6. ABC-ELISA

  21. 抗原测定方法： 双抗体夹心法 竞争法 抗体测定方法： 间接法 双抗原夹心法 竞争法 捕获法 总结：ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体

  22. 方法评价 • 操作简便、快速、敏感性高、特异性强、实验设备要求较简单、应用范围广泛、无放射性同位素污染

  23. ELISA的技术要点 1. 固相载体 聚丙乙烯 聚氯乙烯 微孔滤膜 磁性微粒子 2.免疫吸附剂、包被的过程

  24. 3.测定方法的标准化 a. 加样 b. 保温 c. 洗涤：很关键 d. 比色

  25. 二、实验原理（见说明书） • 抗AFPAb1—AFP－抗AFPAb2－HRP 三、方法和步骤（见说明书） (1)ELISA基本步骤： • 本实验2人一组，每组4孔：阳性对照、阴性对照、待测标本、空白孔 • 全班第一组用标准品加样，并根据检测结果拟合标准曲线。 (2)酶标仪使用（免疫检验实验讲义P21）

  26. 四、结果和讨论 (1)结果报告 • 目测：看每孔的颜色变化及区别 • 酶标仪检测：拟合标准曲线，并根据拟合的标准曲线算出待检标本AFP的含量。 (2)结果分析

  27. 甲胎蛋白 (alpha fetoprotein , AFP) 一般性质：肝脏和卵黄囊合成，糖蛋白，70kD 检测方法：RIA，化学发光免疫测定 临床意义： 1.原发性肝癌：　　77%AFP>500ng/ml 18%AFP<25ng/ml 2.生殖腺胚胎性肿瘤 3.病毒性肝炎、肝硬化<300ng/ml 4. 妇女妊娠期： 3个开始，7-8月个月达高峰，〈400ng/ml

  28. 五、思考题 1.本实验所用的底物是什么？ 2.影响ELISA的因素有哪些？应采取什么措施确保实验的准确性？

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